新規核蛋白質制御系を用いたアデノ随伴ウイルスベクター産生細胞株の樹立

1999 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 10557035
• 研究機関: 自治医科大学
• 研究代表者: 卜部 匡司 自治医科大学, 医学部, 助手 (40213516)
• 研究分担者: 高橋 亘 三共バイオメディカル研究所, 副主任研究員 ; 久米 晃啓 自治医科大学, 医学部, 講師 (10264293) ; 小澤 敬也 自治医科大学, 医学部, 教授 (30137707)
• キーワード: アデノ随伴ウイルス / パッケージング細胞 / 核蛋白質 / プロテアーゼ

研究概要

昨年度の結果より、核蛋白質を膜蛋白質とのキメラとして発現させ、細胞膜直下の細胞質に強制的に留めておき、さらに核蛋白質を膜蛋白質から遊離させるため、両者の間にプロテアーゼの認識配列を挿入しておき、そのプロテアーゼを必要時に一過性に発現させて核蛋白質部分を核へ移行させることが、核移行シグナルを付加したβガラクトシダーゼ発現のモデル実験より明らかになった。本年度はこのシステムをRep蛋白質に応用することを試みた。
AAVのp5プロモーター下にgranulocyte colony stimulating factor receptor(GCSF-R)とlarge Repのキメラ蛋白質を第1シストロンに、encephalomyocarditis virusのinternal ribosome entry site(IRES)下流の第2シストロンにブラストサイジン耐性遺伝子を配したプラスミドを293細胞にトランスフェクションしてブラストサイジン存在下で培養を行い、クローンを幾つか選び出した。それらのクローンに、small Rep/Cap発現プラスミド、LacZ AAVベクタープラスミド、アデノウイルスヘルパープラスミドの3者にNlaプロテアーゼ発現プラスミドをコトランスフェクションし、産生するAAV-LacZベクターの量を測定した所、Nlaプロテアーゼを用いない場合に比べ、10倍産生量が増加するクローンを得ることができた。このことは細胞毒として働くRep蛋白質の機能をNlaプロテアーゼによって制御することができたことを示している。しかし、Nlaプロテアーゼの非発現状態でもAAVベクターが産生されることより、Rep蛋白質の細胞内局在を完全には制御できていない可能性があり、今後の課題として残る。

研究成果

• [文献書誌] Kume,A.: "Hematopoietic stem cell gene therapy : a current overview"Int.J.Hematol.. 69. 227-233 (1999)
• [文献書誌] Ogasawara,Y.: "Highly regulated expression of adeno-associated virus large Rep proteins in stable 293 cell lines using the Cre/loxP switching system"J.Gen.Virol.. 80. 2477-2480 (1999)
• [文献書誌] Urabe,M.: "A switching system regulating subcellular localization of nuclear proteins using a viral protease"Biochem.Biophys.Res.Commun.. 266. 92-96 (1999)
• [文献書誌] Urabe,M.: "DNA/Calcium phosphate precipitates mixed with medium are stable and maintain high transfection efficiency"Anal.Biochem.. 278. 91-92 (2000)
• [文献書誌] Urabe,M.: "Charged-to-alanine scanning mutagenesis of the N-terminal half of adeno-associated virus type 2 Rep 78 protein"J.Virol.. 73. 2682-2693 (1999)
• [文献書誌] Xu,R.: "A selective amplifier gene for tamoxifen-inducible expansion of hematopoietic cells"J Gene Med.. 1. 236-224 (1999)