| 研究課題/領域番号 |
10557074
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 展開研究 |
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| 研究分野 |
小児科学
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
成澤 邦明 東北大学, 大学院・医学系研究科, 教授 (90004647)
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| 研究分担者 |
鈴木 洋一 東北大学, 大学院・医学系研究科, 助手 (80216457)
呉 繁夫 東北大学, 大学院・医学系研究科, 助手 (10205221)
松原 洋一 東北大学, 大学院・医学系研究科, 助教授 (00209602)
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| 研究期間 (年度) |
1998 – 1999
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| キーワード | 既知遺伝子変異 / Taq Man ASA法 / AYBR Green-ASA法 / アレル特異的プライマー / フェニルケトン症 / 糖原病1a型 / 中鎖アシルCoA脱水素酸素欠損症 |
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| 研究概要 |
既知遺伝子変異(多型を含む)の検出は遺伝病の遺伝子診断ばかりでなく、家族性腫瘍やCommon Diseaseの危険因子の検査、さらには個人識別などの法医鑑定上でも極めて有用な手段となっている。本研究は既知小変異を迅速に精度よく検査するための自動既知変異検出システムTaq Man ASA法及びSYBR Green-ASA法を確立する事にある。これらの方法はアレル特異的プライマー(野生型プライマー及び変異型プライマー)によって産生されたPCR産物を蛍光強度としてリアルタイムで測定し、自動化したものである。本研究によってTaq Man ASA法が確立できた変異は日本人患者に多くみられる変異が中心であり、具体的にはフェニルケトン症のR111X、IVS-4、Y204C、R241C、R243Q、V245V、R252W、R278W、IVS-9、Y356X、R413P変異、糖原病1a型のg727t変異、中鎖アシルCoA脱水素酵素欠損症のK329E変異(白人に高頻度)である。多くのアレル特異的プライマーは3'端から-2或いは-3にミスマッチ塩基を導入して作成した。PCRの進行により、プライマーの3'端の塩基がマッチしたテンプレイトでは蛍光強度が増加するが、マッチしていなければ強度は増加しない。その強度はABI PRISM 7700 Sequence detection Systemでリアルタイムで行った。PCR増幅量の多寡は蛍光シグナルの検出スレショルドを越えるサイクル数(C_T)で評価した。今回検討したすべての変異で正常、変異ホモ接合体、ヘテロ接合体の識別が可能であり、本法が自動既知変異検出法として極めて有用な方法であることを示した。
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