Duchenne型筋ジストロフィーの新しい治療法の確立

1999 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 10557076
• 研究機関: 神戸大学
• 研究代表者: 松尾 雅文 神戸大学, 医学部, 教授 (10157266)
• 研究分担者: 竹島 泰弘 神戸大学, 医学部・附属病院, 助手 (40281141)
• キーワード: ジストロフィン / スプライシング / スプライシング促進配列 / 治療

研究概要

私たちは、Duchenne型筋ジストロフィー(DMD)患者でmRNA前駆体のスプライシングを操作することによりmRNAのアミノ酸読み取り枠を修正し、機能的なタンパクを産生させることでDMDの治療ができることを独自に着想した。このスプライシングを操作するためには、ジストロフィン遺伝子のエクソン内のスプライシング促進配列の解明が必須となっている。そこで、ジストロフィン遺伝子のエクソン配列中に存在するスプライシング促進配列の解明につとめた。ここでは、ジストロフィン遺伝子の欠失変異のホットスポットの周辺のエクソン43、46、52の各エクソンを対象として検討した。これら3つのエクソンの配列の中からスプライシング促進配列の候補となる配列を選び、そのスプライシング促進能の有無を解析した。すなわち、この候補配列をショウジョウバエのDSX遺伝子に組み込み、ミニ遺伝子を作成した。このミニ遺伝子を転写させてmRNA前駆体を得た。次いで、このmRNA前駆体をHeLa細胞核抽出液と混じスプライシング反応を進行させた。そして、スプライシング産物の多少を解析することにより組み込んだ配列のスプライシング促進能の強弱を判定した。
今回調べた3種の候補配列の中で、エクソン43由来の塩基配列が最も強くスプライシングを促進する機能があることを示す結果を得た。エクソン52由来の配列もスプライシング促進能を弱く示したが、エクソン46由来の配列は殆どその作用を有していなかった。これらのことは、スプライシング促進配列は各エクソンに固有の配列であることを示した。

研究成果

• [文献書誌] Surono,A,Takeshima,Y,Wibawa,T,Ikezawa,M,Nonaka,I and Matsuo,M.: "Circular dystrophin RNAs consisting of exons that were skipped by alternative splicing"Hum Mol Genet. 8. 493-500 (1999)
• [文献書誌] Patria,SY,Takeshima,Y,Suminaga,R,Nakamura,H,Iwasaki,R,Minagawa,T,and Matsuo,M.: "A simple explanation for a case of incompatibility with the reading frame theory in Duchenne muscular dystrophy: failure to detect an aberrant restriction fragment in Southern blot anlysis"Brain Dev. 21. 386-389 (1999)
• [文献書誌] Dwi Pramono,ZA,Takeshima,Y,Surono,A,Ishida,T and Matsuo,M.: "A novel cryptic exon in intron 2 of the human dystrophin gene evolved from an intron by acquiring consensus sequences for splicing at different stages of anthropoid evolution"Biochem Biophys Res Commun. 267. 321-328 (2000)
• [文献書誌] Wibata,T,Takeshima,Y,Mitsuyoshi,H.,Surono,A,Nakamura,H and Matsuo,M.: "Complete skipping of exon 66 due to novel mutations of the dystrophin gene was identified in two Japanese families of DMD with severe mental retardation"Brain Dev. (in press). (2000)
• [文献書誌] Suminaga,R,Takeshima,Y,Wada,H,Nanamura,H and Matsuo,M.: "Analysis of a nonsense mutation of the alpha-actinin-3 gene in Japanese patients with dystrophinopathy"Am J Med Genet. (in press). (2000)