リポソーム封入アネキシン-V及び関連ペプチドの抗塞栓作用

2000 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 10557092
• 研究機関: 九州看護福祉大学
• 研究代表者: 船越 崇行 九州看護福祉大学, 看護福祉学部, 教授 (90150549)
• 研究分担者: 溝上 寛 化学及び血清療法研究所, 試作研究部, 部長 ; 島田 秀昭 熊本大学, 薬学部, 助手 (40226212) ; 田中 晴人 九州看護福祉大学, 看護福祉学部, 教授
• キーワード: Annexin-V / 抗凝固ペプチド / リポソーム封入 / Ca^<2+>依存性膜結合蛋白質 / 抗凝固作用部位 / 抗血栓作用

研究概要

本研究はAnnexin-V及びその作用部位ペプチドの塞栓防御作用を利用し、抗血栓剤としてより効果的に応用する目的で研究を遂行した。その結果、以下のような成果を得た。
1.Annexin-Vの培養調製:Annexin-VのcDNAをプラスミドベクター(pUC18)ヘクローニングし、これを酵母菌を含む培養液中で培養した。この培養液を硫安分画、DEAE-Sepharose吸着、Sephadex G-75及びMono S(HPLC)を用いてAnnexin-Vを調製した。このリコンビナントAnnexin-Vはヒト胎盤から精製したAnnexin-Vと同様の性質を示し、同程度の抗凝固・抗塞栓作用を持つことが明らかになった。
2.作用部位関連ペプチドの化学合成:Annexin Vの作用部位ペプチドDHTLIRの類似ペプチド、HDTLIR、HDTQPRVLD,ペプチドの生体内半減期を長くするためにそのN末端をAcetyl基、C末端をNH_2基でブロックしたり(Ac-HDTQPRVLD-NH2,Ac-hDTQPRVLd-NH2)、N末端とC末端をS-S架橋でつないだ環状ペプチド(Ac-cHDTQPRVLDc-NH_2)等を化学合成し、これらをHPLC(逆相カラム)で精製して、その抗凝固作用(in vitro)及び抗塞栓作用(in vivo)について解析した。
3.リポソーム封入Annexin-V及びその作用部位関連ペプチドの抗凝固・抗塞栓作用作用:リコンビナントAnnexin-V及び上記ペプチドを各種リポソームへ封入し、その作用を検討した結果、抗凝固・抗塞栓作用作用はペプチド単独に比して低下することが判明した。
4.抗塞栓作用:肺塞栓モデルマウスはマウス尾静脈より、30-40mg/kgのリオプラスチン(組織因子、リン脂質を含む)を投与することによって作成し、これに対するリポソーム封入Annexin-V及び抗凝固ペプチドの抗血栓作用をその延命効果で判定した結果、リポソーム封入によりペプチドの抗血栓作用は低下した。
5.リン脂質膜(細胞膜)結合能:Annexin-V及び抗凝固ペプチドはホスファチジルセリンに特異性を示した。
6.副作用・毒性の検討:マウス、ラット、モルモット、ウサギを用いてAnnexin-V及び抗凝固ペプチドを投与した場合の副作用および毒性は全く認められなかった。
7.抗塞栓剤の開発:肺塞栓モデルマウスを用いてAnnexin-V及び関連ペプチド並びにこれらのリポソーム封入体の延命効果を検討し、塞栓防御作用の優れているものを選択し、新しい型の抗血栓剤としての応用を検討中である。

研究成果

• [文献書誌] 船越崇行: "Effects of Calcium and Lanthanide Ions on the Binding Ability of Annexin V to Phospholipid Vesicle,"J.Kyushu Univ.Nursing and Social Welfare. 2. 49-55 (2000)
• [文献書誌] 島田秀昭: "Acute nontoxic cadmium exposure inhibits Pancreatic Protease Activities in the Mouse,"Toxicological Sciences. 53. 474-480 (2000)
• [文献書誌] 島田秀昭: "Increase of Calcium Concentration in the Testes with Rare Earth Metals,"J.Health Sci.. 46. 314-316 (2000)
• [文献書誌] 船越崇行: "Studies of Antithrombus Action of Annexin-V and Rerated Peptides,"J.Kyushu Univ.Nursing and Social Welfare. 1. 21-27 (1999)
• [文献書誌] 船越崇行: "Preparation of Antibody to Lipoprotein Lipase (LPL) Using Synthetic Peptides"J.Kyushu Univ.Nursing and Social Welfare,1,21-27 (1999). 1. 29-34 (1999)
• [文献書誌] 船越崇行: "アネキシン-V及び関連ペプチドの抗血液凝固・抗血栓作用"生化学. 71・8. 732 (1999)
• [文献書誌] 船越崇行: "アネキシン-V及び関連ペプチドの塞栓防御作用に関する研究"佐川先端科学振興財団. 20-29 (1998)