| 研究課題/領域番号 |
10557097
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 研究機関 | 杏林大学 |
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研究代表者 |
細山田 真 杏林大学, 医学部, 助手 (00291659)
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| 研究分担者 |
遠藤 仁 杏林大学, 医学部, 教授 (20101115)
金井 好克 杏林大学, 医学部, 助教授 (60204533)
武田 理夫 杏林大学, 医学部, 講師 (40255401)
関根 孝司 杏林大学, 医学部, 助手 (50255402)
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| キーワード | トランスポーター / 有機酸 / 培養細胞 / hOAT1 / 腎臓 |
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| 研究概要 |
1. ヒト腎臓血管側有機酸トランスポーター(hOATl)安定発現細胞株の作出。
真核細胞発現ベクターpcDNA3.1に組み替えたヒト型血管側有機酸トランスポーターhOAT1cDNAを、チャイニーズハムスター卵母細胞株(CHO)、ブタ由来腎上皮細胞株(LLC-PK_1)、ヒト胎児腎細胞株(HEK)に遺伝子導入し、hOAT1安定発現細胞株を樹立した。hOAT1安定発現HEK細胞株は付着性に若干問題があった。hOAT1安定発現CHO細胞株およびhOAT1安定発現LLC-PK_1細胞株は輸送実験により、hOAT1の典型的な基質であるパラアミノ馬尿酸の取り込みを認めた。さらにhOAT1安定発現LLC-PK_1細胞では基底側培養液から頂上側培養液のパラアミノ馬尿酸の一方向性輸送が認められ、傍上皮輸送のマニトールの輸送は認められなかったので、パラアミノ馬尿酸の経上皮輸送を示すhOAT1安定発現細胞株が樹立できた。
2. ラット管腔側有機酸トランスポーター遺伝子のクローニング。
ラット腎臓のmRNAをサイズにより分画し、ラットOAT1の合成cRNAと共にツメガエル卵母細胞に微量注入する。OAT1を介してあらかじめ細胞内に取り込ませた典型的有機酸の^<14>C-パラアミノ馬尿酸の分泌活性を調べ、分泌に関与するmRNAサイズは2.8kb付近であると同定した。同定されたmRNA分画よりcDNAライブラリーを作成し、プラスミドDNAからcRNAを合成してツメガエル卵母細胞で検討したところ、^<14>C-パラアミノ馬尿酸の分泌活性を認めた。次年度以降さらにスクリーニングを続行する予定である。
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