人工臓器作製を目指した基底膜再構築の基礎研究

1999 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 10557113
• 研究機関: 岡山大学
• 研究代表者: 二宮 善文 岡山大学, 医学部, 教授 (70126241)
• 研究分担者: 植木 靖好 岡山大学, 医学部, 助手 (60304309) ; 百田 龍輔 岡山大学, 医学部, 助手 (80263557) ; 大橋 俊孝 岡山大学, 医学部, 講師 (50194262) ; 白井 朋子 岡山大学, 医学部, 助手 (30304299)
• キーワード: 発現ベクター / 無細胞翻訳 / 上皮細胞

研究概要

ヒトα(IV)鎖をコードする各cDNAの発現系の確立
ヒトα5(IV)鎖をコードする重複cDNAを連続したひとつの全長cDNAコンストラクトを作成した。これをT7RNAポリメラーゼによって転写させたRNAを純化し、無細胞翻訳系に投入し、翻訳させると、全長α5(IV)cDNAコンストラクトからは、180kDaほどのサイズのポリペプチドを作らせることができた。さらにこの翻訳産物を純化した細菌性コラゲナーゼで消化すると、低分子に消化された。このことは、作成した全長α5(IV)cDNAコンストラクトが正しいヒトα5(IV)鎖をコードするcDNAであり、目的のコンストラクトが目的の通り作成できていることを示している。
同様のコンストラクトをヒトα6(IV)鎖をコードする重複cDNAについても行ない、全長α6(IV)cDNAコンストラクトを作成することができた。
ホスト細胞の基底膜産生とトランスフェクションのための選択
上記全長α(IV)cDNAコンストラクトをトランスフェクションするホスト細胞について検索を行なった。全長α5(IV)cDNAを単離することができた自然にトランスフォームされた表皮細胞であるPAM細胞、チャイニーズハムスターからの卵巣細胞(CHO細胞)、甲状腺由来の上皮細胞(TCO細胞)、T細胞由来Jurkat細胞を調べた。その結果、PAM細胞とCHO細胞はα5(IV)鎖を、TCO細胞はα3(IV)鎖とα4(IV)鎖を産生しているがJurkat細胞はどのα(IV)鎖も産生していないことがことが分かった。この結果をもとに、Jurkat細胞にはα5(IV)遺伝子、α6(IV)遺伝子を単独に、PAM細胞とCHO細胞にはα6(IV)遺伝子をトランスフェクションすることによってα5/α6鎖で構成される分子の検索を、TCO細胞にはα5(IV)遺伝子をトランスフェクションすることによってα3/α4/α5鎖で構成される分子の会合体の解析を行なうことができる。

研究成果

• [文献書誌] van Wezell et al.: "Ultrastructure and composition of call-exner bodies in bovine follicles"Cell Tissue Res.. 296. 385-394 (1999)
• [文献書誌] Nakano S et al.: "Differential Tissular Expression and Localization of Type IV collagen α^1(IV),α^2(IV),α^5(IV) and α^6(IV) chains and their mRNAs"Laboratory Investigation. 79. 281-292 (1999)
• [文献書誌] Toth M. et al.: "Biosynthesis of α^2(IV) and α^1(IV) chains of collagen IV and interactions with matrix metalloprotenases-9"J. Cell Physiol. 180. 131-139 (1999)
• [文献書誌] Lee G E et al.: "New form of X-linked dominant hereditary nephritis in dogs"Am. J. Vet. Res... 60. 373-383 (1999)
• [文献書誌] Zheng K et al.: "Absence of the α^6(IV) chain of collagen type IV in Alport syndrome is related to a failure at the protein assembly ecol"Am. J. Pathol. 154. 1883-1891 (1999)