初期胚・胎児異常の疾患遺伝子診断と形態機能学的解析

2000 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 10557149
• 研究機関: 慶應義塾大学
• 研究代表者: 吉村 泰典 慶應義塾大学, 医学部, 教授 (10129736)
• 研究分担者: 石本 人士 慶應義塾大学, 医学部, 助手 (10212937) ; 宮崎 豊彦 慶應義塾大学, 医学部, 講師 (20174162) ; 末岡 浩 慶應義塾大学, 医学部, 助教授 (90162833)
• キーワード: 着床前遺伝子診断 / Duchenne型筋ジストロフィー / ジストロフィン遺伝子 / パワードプラ法 / fetal angiography

研究概要

着床前遺伝子診断(PGD)において、単一細胞からの疾患遺伝子診断の困難性が従来より指摘されている。DNA抽出不良がその一因として考えられており、各国において様々な方法が試みられてはいるが、しかし未だ完成した方法は無い。我々は、簡潔で、しかも効率の良いDNA抽出法(Spanning protocol)を開発し、従来のDNA抽出法と比較検討した。インフォームドコンセントを得た上で体外受精余剰胚(割球・極体)、リンパ球を検討に供した。第一に割球・極体・リンパ球に対して、各々のDNA抽出法(Water method,Freezing and boiling method,Two-step lysis protocol,Spanning protocol)を用いて、Duchenne型筋ジストロフィー(DMD)欠失型を対象とし、dystrophin遺伝子のExon44と45に対するMultiplex nested PCRを施行、DNA増幅効率・診断効率を比較検討した。第二に他病型に対する検討としてDMD点変異型を対象とし、Multiplex nested PCR-Sequencerによる効率を比較検討した。第三に他疾患への応用として、Menkes病(欠失型)、Lowe症候群(点変異型)についても同様に比較検討した。増幅効率は、Water methodは50%、Freezing and boiling methodは35%、Two-step lysis protocolは85%であったのに対し、Spanning protocolは90%の高い増幅効率を示し、全種の細胞において有効であった。偽陰性もTwo-step lysis protocolが10%であるのに対しSpanning protocolは2.5%と低い値を示した。Menkes病欠失診断、Lowe症候群点変異診断も同様にSpanning protocolで最も高効率であった。
我々が開発したSpanning protocolは従来のDNA抽出法に比べ、操作手技が簡単であることからcontamination等の診断ミスの危険を回避できるのみならず、高い増幅効率を示し、PGDのDNA抽出法として極めて有用であると思われた。本法で効率良くDNAを抽出することにより、欠失診断だけでなく点変異診断にも応用可能であり、またMenkes病・Lowe症候群等の他疾患に対しても有効で、単一細胞からの疾患遺伝子の診断情報拡大の可能性が示唆された。

研究成果

• [文献書誌] Asada H,Yoshimura Y, et al.: "The effects of age and abnormal sperm count on the nondisjunction of spermatozoa."J Assist Reprod Genet. 17. 51-59 (2000)
• [文献書誌] Hamatani T,Yoshimura Y, et al.: "A monoclonal antibody to human SP-10 inhibits in vitro the binding of human sperm to hamster oolemma but not to human zona pellucida."Biol Reprod. 62. 1201-1208 (2000)
• [文献書誌] Hashiba T,Yoshimura Y, et al.: "Accurate multiplex polymerase chain reaction assay for gender determination from a single cell."Gynecol Obstet Invest. 49. 217-220 (2000)
• [文献書誌] Hanabusa H,Yoshimura Y, et al.: "An evalution of semen processing methods for eliminating HIV-1."AIDS. 14. 1611-1616 (2000)
• [文献書誌] Shinmoto H,Yoshimura Y, et al.: "MR imaging of NON-CNS fetal abnormalities : A pictorial essay."Radiographics. 20. 1227-1243 (2000)
• [文献書誌] Yoshimura Y: "Clinical implications of insulin-like growth factors and their binding proteins in reproduction"Endocr J. 47. 493-515 (2000)
• [文献書誌] 吉村泰典: "不妊症の病態生理と診断・治療"真興交易医書出版部. 156 (2000)