| 研究課題/領域番号 |
10557227
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
寺崎 哲也 東北大学, 薬学部, 教授 (60155463)
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| 研究分担者 |
福島 清実 大正製薬, 開発研究所・薬物動態研究室, 室長
菊池 明彦 東京女子医科大学, 医学部, 助手 (40266820)
帯刀 益夫 東北大学, 加齢医学研究所, 教授 (10099971)
細谷 健一 東北大学, 教務職員 (70301033)
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| キーワード | 血液脳関門 / 脳毛細血管内皮細胞 / 温度感受性SV40T抗原遺伝子導入トランスジェニック動物 / 脳 / 不死化細胞クローン / P-糖蛋白 / GLUT-1 / グルコース輸送 |
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| 研究概要 |
温度感受性SV40T抗原遺伝子導入トランスジェニックマウスの大脳より脳毛細血管内皮細胞をcollagenase/dispase処理及び密度勾配法により採取し、10%FBS含有DMEM培地にて5%CO_2雰囲気下33度で培養した。増殖の速い細胞株について2回コロニー形成を行い、ペニシリンカップを用いて単一細胞由来の細胞株(TM-BBB)5株を単離した。これらTM-BBBは内皮細胞特有のspindle-fiber状の形状を示し、Western blot法によりSV40T抗原の発現が明らかとなった。TM-BBBは20から25時間のdoubling timeで増殖し、100代の継代においても細胞の形状に大きな変化はなかった。脳毛細血管内皮細胞での存在が報告されているGLUT-1及びP-糖蛋白が発現していることがWestem blot法により明らかとなった。さらに、Northern blot法によりin vivoに発現しているP-糖蛋白のmRNA、mdr 1aの発現が明らかとなり、単離した細胞株は脳毛細血管内皮細胞であることが示された。さらにGLUT-1の基質である[^3H]-3-O-methyl-D-glucose([^3H]-3-OMG)の細胞内取り込み量は少なくとも30秒は直線を示し、その初期取り込み速度は2.6から5.3 μl/(min・mg protein)であった。[^3H]-3-OMGのTM-BBBの取り込みは濃度依存性を示した。Michael is定数は6.6mM、最大取り込み速度は44nmol(min・mg protein)であった。従って、本法によって増殖可能で3-OMG(D-glucose)の輸送機能を有した脳毛細血管内皮細胞株が樹立できた。
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