質量分析計を用いたHLA-DNAタイピングの自動化機械の開発

1999 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 10557252
• 研究機関: 東海大学
• 研究代表者: 猪子 英俊 東海大学, 医学部, 教授 (10101932)
• 研究分担者: 西村 直行 島津製作所, 基盤技術研究所・医療グループ, 主任研究員 ; 安藤 麻子 東海大学, 医学部, 講師 (40101935)
• キーワード: HLAタイピング / 質量分析 / 自動判定 / 対立遺伝子 / 高速液体クロマトグラフィー

研究概要

1).HLA-DRB1遺伝子のDR4グループを用いて、PCR反応後の検体を塩基配列の違いを認識する制限酵素で切断してから質量分析計にて測定を行ったところ、実測値にばらつきが生じ、高精度な再現性が得られなかった。このばらつきの原因は、制限酵素処理を行った産物では、反応用バッファーの微量な混入が測定結果の精度に大きく影響していることが考えられたため、試料サンプルの精製法について検討した。すなわち、さらに高精度なカラムとエタノール沈澱での精製を組み合わせた精製法を用いて測定を行った結果、測定値のばらつきはかなり改善が見られたが、精製に要する時間が大幅に増加した。そこで、制限酵素処理の方法に代わって、塩基配列に特異的なプライマーを多数用いて、PCRでの増幅が行われるか否かのみにて判定を行う、PCR-SSP法を本法に採用し、増幅産物の測定を行うこととした。結果、精製度は制限酵素を用いた場合よりも簡易に行ったが、測定には影響を与えなかった。
2).すでに自動化のめどが立っている、DNA抽出、PCR増幅と高速液体クロマトグラフィーによる逆相カラムの各行程との間に、脱塩カラムによる精製の行程を加えての自動化が可能となるように、機器の改良を行った。制限酵素処理の行程が削除されたため、各行程の組合せについては改良が進んだが、プライマーセットの増加により遺伝子型判定のためのコンピューターソフトのプログラミングについて、再構築を行った。その結果、現在の製精度では、ヘテロ接合体での判定が困難な組合せが存在することが明かになった。この問題を解決するには、PCR増幅産物の長さを100bpにとどめ、可能な限り分子量を小さくすることで測定可能と考えられた。

研究成果

• [文献書誌] Naruse TK, et al.: "Limited polymorphism in the HLA-DOA gene."Tissue Antigens. 53. 359-365 (1999)
• [文献書誌] Moribe T, et al.: "Rapid HLA class I DNA typing using microtiter plate-reverse hybridization assay(MRHA) by simple thermoregulation:High resolution subtyping of HLA-A2 and-B40 alleles"Hum Immunol. 60. 539-549 (1999)
• [文献書誌] Takashige N, et al.: "Genetic polymorphisms at the tumor necrosis factor loci(TNFA and TNFB)in cardiac sarcoidosis"Tissue Antigens. 54. 191-193 (1999)
• [文献書誌] The MHC sequencing consortium(Aguado B, et al): "Complete structure and gene map of a human major histocompatibility complex(MHC)"Nature. 401. 921-923 (1999)
• [文献書誌] Yabuki K, et al.: "HLA class I and II typing of the patients with Behcht's disease in Saudi Arabia"Tissue Antigens. 54. 273-277 (1999)
• [文献書誌] Katuyama Y, et al.: "Sequencing based typing for genetic polymorphisms in exons 2, 3 and 4 of the MICA gene"Tissue Antigens. 54. 178-184 (1999)
• [文献書誌] Yabuki K, et al.: "Dev Ophthalmol"Kargar. 15 (1999)
• [文献書誌] Kanaya S, et al.: "Major Histocompatibility Complex; Evolusion, Structure and Function"Springer. 15 (2000)