| 研究課題/領域番号 |
10557252
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 展開研究 |
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| 研究分野 |
病態検査学
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| 研究機関 | 東海大学 |
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研究代表者 |
猪子 英俊 東海大学, 医学部, 教授 (10101932)
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| 研究分担者 |
西村 直行 島津製作所, 基盤技術研究所・医療グループ, 主任研究員
安藤 麻子 東海大学, 医学部, 講師 (40101935)
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| 研究期間 (年度) |
1998 – 1999
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| キーワード | HLAタイピング / 質量分析 / 自働判定 / 対立遺伝子 / 高速液体クロマトグラフィー |
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| 研究概要 |
分子量の試料サンプルの測定に関する検討では、核HLA対立遺伝子の塩基数が同一の場合は判別が困難なことが予想されたため、制限酵素で切断を行ったが、高速液体クロマトグラフィー分析の際には、精製後に残存するわずかな夾雑物の混入をも測定するために、実測値にばらつきが生じ、高精度な再現性が得られなかった。そこでさらに高精度な精製を試みたが、精製に要する時間が大幅に増加した。測定の前段階で時間を浪費する精製は、本法の自動化にとっては致命的であると考え、制限酵素処置の方法に代わって、PCR-SSP法を採用することを試みた。PCR反応後のサンプルを、制限酵素を用いた場合よりも簡易に精製後、順に測定を行い判定したが良好な結果を得たことから、PCR-SSP法を用いてMS法の自動化を行うこととし、自動化にむけての行程を検討した。
PCR-SSP法のプライマーセットの増加により、遺伝子型判定のためのコンピューターソフトのプログラミングについて、再構築を行うこととなった。しかしながら現在の精製度では、増幅領域の長さから分子量が120,000を越えるため、PCR増幅産物の長さを100bpにとどめ、可能な限り分子量を小さくすることが必要となった。そこで新たに90bpのPCR産物を作製したところ、簡易精製で均一な測定値を得ることに成功した。また、プライマーセットの増加に対応するため、測定機器についてもスライドチップによる測定時間の短縮化を検討し、終了させた。我々の予備的な研究では、PCRプライマーをさらに狭い領域に設定し、PCR産物の分子量を5万以下に設定すれば、磁場収束型のESイオン化法により一塩基の違いのHLA型も識別しうることが判明しているので、技術的には明るい展望が開けたと考える。
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