還元末端よりの糖鎖シークエンシング法の開発

1998 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 10558100
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 長谷 純宏 大阪大学, 大学院・理学研究科, 教授 (80028232)
• 研究分担者: 塚本 滋久 医理化機器(株), 開発研究部, 研究員
• キーワード: 糖鎖 / 2次元マップ / ピリジルアミノ化 / オリゴ糖 / 部分水解

研究概要

本研究では、部分水解による還元末端よりの構造解析の確立と2次元糖鎖マップを組み合わせた分析法の確立とこれを行うためのコンピューターソフトの作成を行う。本研究では、規格化の困難な酵素消化の代わりに部分酸加水分解を用い、得られたPA-オリゴ糖をHPLC2次元糖鎖マップ法で同定し、これらの断片より元の糖鎖構造を明らかにする。この時に検出出来るのは標識の結合した還元末端由来の糖鎖のみであるため、還元末端より糖鎖構造を解析出来る。従って、6pmolの糖鎖の0.5%の水解物も同定出来るため高感度である。これらを組み込んだ、PA-糖鎖断片より元の糖鎖構造を解析するソフトを開発する。化学的に安定な蛍光誘導体にして糖鎖構造を解析する蛍光標識法や、2次元糖鎖マップ、溶出位置と構造間の規則性、糖鎖のパターン解析等を基盤とし、糖鎖の分野の自動構造解析装置の基礎を確立する。構造解析を汎用で行うためにはコンピューターソフトの作成が必要である。
ビリジルアミノ化ハイマンノース型糖鎖やコンプレックス型糖鎖を用いて、部分加水分解の条件を検討した。使用する酸の種類(塩酸、トリフルオロ酢酸、メタノール一塩酸等)や濃度、温度、時間等を検討した。部分水解物をサイズ分画HPLCと逆相HPLCで分離し、元のPA-糖鎖からPA-GlcNAcまでのPA-少糖を幅広く得られる水解条件を設定した。得られたビリジルアミノ化少糖断片の2次元糖鎖マップによる構造解析から、元の糖鎖構造を解析し、本方法の有用性を確認した。

研究成果

• [文献書誌] Hiroyuki Wakabayashi: "Novel Proteoglycan Linkage Tetrasaccharides of Human Urinary Soluble Thrombomodulin: SO4-3GlcAβ1-3Ga1B1-3(±Siaα±2-6)Galβ1-4Xyl" J.Biol.Chem.in press. (1999)
• [文献書誌] Ichiro Fujimoto: "Systematic Analysis of N-linked Sugar Chains from Whole Tissue Employing Partial Automation" Anal.Biochem.in press. (1999)
• [文献書誌] Atsuyuki Shimazaki: "A New Sugar Chain of the Proteinase Inhibitor from Latex of Carica papaya" J.Biochem.in press. (1999)
• [文献書誌] Kazuma Iwai: "Detection of Man5GlcNAc and Related Free Oligosaccharides in the Cytosol Fraction of Hen Oviduct" J.Biochem.125. 70-74 (1999)
• [文献書誌] Kanta Yanagida: "Introduction of a New Scale into Reversed-phase High-performance Liquid Chromatography of Pyridylamino Sugar Chains for Structural Assignment" J.Chromatogr.A. 800. 187-198 (1998)
• [文献書誌] Yasushi Makino: "Analysis of Oligosaccharide Structures from the Reducing End Terminal by Combining Partial Acid Hydrolysis and a Two-dimensional Sugar Map" Anal.Biochem.264. 172-179 (1998)
• [文献書誌] Shunji Natsuka: "Analysis of N- and O-Glycans by Pyridylamination" Humana Press, 13 (1998)