選択的スプライシング因子を単離するための新しい発現クローニング方法の研究

1998 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 10558102
• 研究機関: 東京医科歯科大学
• 研究代表者: 萩原 正敏 東京医科歯科大学, 難治疾患研究所, 教授 (10208423)
• 研究分担者: 室 慶直 名古屋大学, 医学部, 助手 (80270990)
• キーワード: SRPK / SF2 / ASF / リン酸化反応 / スプライシング

研究概要

独自に考案した"Pull Down Kinase Assay"により、HeLa細胞抽出液中にSF2/ASFに結合する蛋白リン酸化酵素活性が存在することが判明したので、このリン酸化酵素をHeLa細胞よりGST-SF2アフィニテイークロマトグラフィーにより精製した。GST-SF2アフィニテイーカラムより高塩で溶出されたSF2リン酸化活性の位置に一致して、95kDa蛋白が銀染色main bandして認められた。ウエスタンブロットにより、この95kDa蛋白が何者であるのか検討したちところ、SRPK1に対するモノクロナール抗体が,この95kDa蛋白に交叉することを見出した。大腸菌で発現させたSRPK1とSRPK2を用いて、GST-SF2 Pull-Down Kinase Assayを行うと、両酵素ともSF2/ASFに結合してリン酸化活性を示した。実際に細胞内でもSF2/ASFとSRPKが複合体を形成していることを、共沈実験で確かめている。このSF2/SRPK複合体の形成にはRSドメインが必須で、RSドメインのリン酸化状態により両者間の親和性が異なる。さらに面白いことには、CREB/CBP複合体形成とは逆に、リン酸化されていないSF2/ASFとSRPKは複合体を形成するが、リン酸化されたSF2/ASFとSRPKはもはや結合しなかった。これだけなら、単に、酵素と基質が結合したて、酵素反応が終わると解離するだけだとも理解できる。SRPKなどSR蛋内をリン酸化する酵素を過剰発現させた細胞内で、核内speckle様構造が崩壊しSF2/ASFは核外に移行する現象が観察されていた。ところが、ATP結合部位を点突然変異により改変してリン酸化活性を喪失させたSRPK2〓をHela細胞内で発現させたところ、驚いたことに、核内でspeckled patternを示したいたSF2/ASFは核外に移行した。この現象から、SF2/ASFの核外移行は、本稿で述べてきたSF2/ASFとSRPKの複合体形成によるためではないかと考え、SRPK1のSF2結合部位欠損ミュータントSPVK1〓〓を作製し、同様にHela絢胞内で発現させると、SF2/ASFは核内にとどまりspeckled patternを示した。

研究成果

• [文献書誌] Okamoto,Y.,Onogi,H.,Honda,R.,Yasuda,H Wakabayashi,T.,Nimura,Y.,& Hagiwara,M.: "cdc2 kinasa-mediated phosphorylation of splicing factor SF2/ASF." Biochem.Biophys.Res.Commun.(in press). (1999)
• [文献書誌] Yoshida Kazuhilo,Imaki Junko,Okamoto Yoshichika,Iwakabe Hideki,Fujisawa Hitoshi,Matsuda Akira,Nakanisi Shigetada,Matsuda Hidehiko,and Hagiwara M.: "CREB-induced transcriptional activation depends on mGluR6 in rod bipolar cells." Mol.Brain Res.57,. 241-247 (1998)
• [文献書誌] Shimomura Atsushi,Okamoto Yoshichika,Hirata Yoko,Kobayashi Makoto,Kawakami Kiyoshi,Kiuchi Kazutoshi,Wakabayashi Takashi,Hagiwara M.: "Dominant Negative ATF1 Blocks Cyclic AMP-Induced Neurite Outgrowth in PC12D Cells." J.Neurochem.70,. 1029-1034 (1998)
• [文献書誌] Muro Yoshinao,Ogawa Yasushi,Kato Yoshihiro,Hagiwara M.: "Autoantibody to thioredoxin reductase in an ovarian cancer patient." Biochem.Biophys.Res.Commun.242,. 267-271 (1998)
• [文献書誌] Kuroyanagi Noriyo,Onogi Hiroshi,Wakabayashi Takashi,Hagiwara M.: "Novel SR-protein-specific kinase,SRPK2,disassembles nuclear speckles." Biochem.Biophys.Res.Commun.242,. 357-364 (1998)
• [文献書誌] Kamimoto Takahiro,Nagai Yasuo,Onogi Hiroshi,Muro Yoshinao,Wakabashi Takashi,Hagiwara M.: "Dymple,a Novel Dynamin-like High Molecular Weight GTPase Lacking a Proline-rich C-terminal Domani in Mammalian Cells." J.Biol.Chem.273,(2),. 1044-1051 (1998)