選択的スプライシング因子を単離するための新しい発現クローニング方法の研究

1999 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 10558102
• 研究機関: 東京医科歯科大学
• 研究代表者: 萩原 正敏 東京医科歯科大学, 難治疾患研究所, 教授 (10208423)
• 研究分担者: 室 慶直 名古屋大学, 医学部, 講師 (80270990)
• キーワード: カルシトニン / alternative splicing / RT-PCR

研究概要

マウスゲノムからカルシトニンexon3-4-5を含むDNA断片(以下cal-exon3-4-5)をPCRにより増幅した。得られたDNA断片をpEGFP-N1のEcoRIサイトに挿入しサブクローニングした。プラスミドDNAをHindIII-NotIで切断し得られたcal-exon3-4-5-EGFP fragmentをpRC/RSVに挿入し、RSVプロモーター制御下でcal-exon3-4-5-EGFPを発現する哺乳類細菌発現ベクターを構築した。構築したベクターをRat2細胞に導入しmRNAを抽出した。センスプライマーをカルシトニンexon3の領域で、アンチセンスプライマーをexon4と5の領域でそれぞれ設計し、得られたmRNAでRT-PCRを行った。その結果、exon3-4に相当する長さのDNA断片が得られ、シーケンスしたところカルシトニンのexon3-4のDNA断片であることが確認できた。このことから非神経細胞内でexon5を含まないスプライシングが起こっていると考えられる。今後、このベクターを神経細胞に導入し、神経細胞内ではexon4を含まずexon5を含むスプライシングが起こることを確認する予定である。Exon5を含むスプライシングが起こればその下流に繋いだEGFPも発現し、長波長光照射下でGFPの蛍光が検出されるはずである。このことが確認されたならば、ベクターを細胞内に導入しG418にてselectionを行い、sable cell lineを確立する予定である。

研究成果

• [文献書誌] Nagai Y, Miyazaki M, Aoki R, Zama T, Inoue S, Hirose K, Iino M, Hagiwara M: "Detection of CAMP-induced phosphorylation with a novel fluorescent indicator."Nat. Biotechnol.. in press (2000)
• [文献書誌] Sakaguchi H, Wada K, Maekawa M, Watsuji T, Hagiwara M: "Song Induced Phosphorylation of CAMP Response Element Binding Protein in the song bird brain."J. Neurosciense. 19. 3973-3981 (1999)
• [文献書誌] Koizumi J, Okamoto Y, Onogi H, Maekawa A, Krainer A, Hagiwara M: "The Subcellular localization of SF2IASF is regulated by the direct interaction with SR protein kinases (SRPKS)"J. Biol. Chem. 274. 11125-11131 (1999)