| 研究概要 |
ニホンナシ'豊水'から単離したS3-RNasaの5'上流域(3Kb)の塩基配列を決定し、5'上流域の-350bpまでがS2-,S3-,S4-,S5-RNase間で高度に保存されていることを明らかにした(平成10年度)。平成11年度はS3-RNaseプロモーター領域におけるcis-elememtを同定するため、S3-RNaseプロモーターのディレーションシリーズにGUS遺伝子を連結したコンストラクトを作成し、タバコに遺伝子導入した。得られた形質転換体におけるGUS遺伝子の発現を調査した。
1)プロモーター解析のための発現ベクター構築
S3-RNaseプロモーター領域のcis-elememtは-350から+1の間に存在すると予想される。S3-RNaseの5'上流域900bpを鋳型としたPCRで9つのS3-RNaseプロモーターディレーションシリーズ(-760,-566,-436,-372,-270,-222,-189,-125)作成した。各プロモーター断片を35Sプロモーターを取り除いたAgrobacteriumのBinary vector pBI121のGUS遺伝子の前に連結したコンストラクトを構築した。
2)形質転換タバコの作出
各コンストラクトをAgrobacterium tumefaciens strain LBA4404に導入した後、タバコのLeaf Disksに感染させた。カナマイシンで選抜を行った結果、-760では37個体,-566では43個体,-436では50個体,-372では58個体,-270では51個体,-222では29個体,-189では45個体,-125では55個体の形質転換体をそれぞれ得ることができた。
3)形質転換体におけるGUS遺伝子の発現
形質転換体の雌ずいにおけるGUS遺伝子の発現をMUGを基質とした蛍光法で測定した。-760(37個体)と-566(43個体)の雌ずいではGUSの高い比活性が認められ,これらの断片にはcis-elementを含まれているいることが明らかになった。平成12年度は、残りの-436,-372,-270,-222,-189,-125のコンストラクトを導入した形質転換体の雌ずいにおけるGUS活性を測定し、cis-elementを同定する。
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