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本年度はリンゴクロロティックリーフスポットウイルス(ACLSV)のORF2がコードする50Kタンパク質(50KP)とGFPの融合タンパク質(50KP-GFP)を用いて、50KP-GFPの細胞間移行能および管状構造形成能、また細胞間移行能できない変異ウイルスに対する50KP-GFPの相補性を検討した。
(1)50KP-GFP遺伝子をパーティクルガン法でNicotiana occidentalisの表皮細胞に導入したところ、50KP-GFPの蛍光が一次発現細胞から周辺の細胞に時間とともに広がる様子が観察された。以上から、50KPそれ自体が細胞間移行能を持っていることが明らかになった。
(2)50KP-GFPをトランジエントに発現するプラスミドDNA(p35S50KGFP)を、N.occidentalis葉から調製したプロトプラストに導入し、50KP-GFPの発現を観察したところ、プロトプラストの表面に50KP-GFPの蛍光を含む管状構造が形成されることが明らかになった。
(3)p35S50KGFPを、ACLSVの感染性cDNAクローン(pCLSF)の50KP遺伝子にストップコドンを導入したpCLStuStopと共にパーティクルガン法でN.Occidentalisに接種し、ノーザンブロット分析した。その結果、pCLStuStopのみの接種ではゲノムRNAが検出されなかったのに対し、p35S50KGFPを同時に接種した場合にはゲノムRNAの増殖が確認された。以上から、50KP-GFPは50KP本来の機能を維持し、ウイルスが細胞間移行するために必要な細胞間移行タンパク質として働くことが明らかになった。
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