| 研究概要 |
2年目の計画変更に伴い、幼若ホルモン(JH)とエクダイソン(20E)の作用が相互干渉する例が知られていることから、両シグナリングが共通のコアクティベータ(CoA)を利用している可能性が高いと考え、JH依存性転写因子クローニングへのステップとして、まずエクダイソンレセプター(EcR)のCoA候補のクローニングと機能解析を行い、以下の結果を得た。
1.蚊を材料として、TBP,Bx42,GCN5,CBP,MBF1のクローニングを行い、前3者に関しては完全長のクローニングを行った。部分クローニングを行ったものを含め、両者とも蚊の因子はショウジョウバエのホモログと最も高い相同性を示した。
2.哺乳類培養細胞(CV-1)とショウジョウバエ培養細胞(S2)を用いて、20E応答配列を持つluciferaseレポーターコンストラクトを、EcR発現コンストラクトとともにtransfectionし、20Eアナログを培地に加えることにより、レポーター活性が上昇する系を作製した。
3.上述の培養細胞系を用いて、Bx42とGCN5の20Eシグナリングに対するコアクティベーション効果を検討した。前者は150%、後者は120%程度のリガンド依存的レポーター活性のさらなる上昇を誘起したことから、この2者はEcRのCoAとして作用することが示された。
4.Mammalian two-hybrid assayを用いて、Bx42・GCN5とEcRとのタンパク・タンパク相互作用を検討した。両者はともに、弱いながらも、EcRと相互作用することが確認された。
今後は、残りのEcRのCoA候補因子の完全長のクローニング・機能解析を行い、JH依存的にこれらの因子と相互作用する転写因子をクローニングする予定である。
|
