| 研究課題/領域番号 |
10660101
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| 研究機関 | 東京理科大学 |
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研究代表者 |
百瀬 春生 東京理科大学, 基礎工学部, 教授 (30219993)
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| 研究分担者 |
島田 浩章 東京理科大学, 基礎工学部, 助教授 (70281748)
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| キーワード | 進化工学 / 実験室内進化 / タンパク質工学 / 低温適応 / ランダム突然変異 / スクリーニング / 酵素活性 / DNAシャフリング |
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| 研究概要 |
本研究では、酵素の人為的「低温適応化」を目的とし、主としてプロテアーゼ(サチライシン)をモデルに進化工学的手法により、低温下で天然型の活性に優る進化型酵素を多数取得してきた。昨年度はそのうちの m-63変異体の変異点G131Dに着目し、同部位におけるランダムアミノ酸置換を行い、低温適応化のメカニズムを詳しくタンパク質工学的に解析した。今年度は、さらに予定の研究計画を完遂すべく、ランダム変異とは異なる進化手法であるDNAシャフリングをまず実行した。これにより、昨年度実施したミューテーション・スクランブリングとともに、サチライシン遺伝子内での種々のキメラ構造を作り、低温適応化への人工進化の可能性を大きく広げることができると期待される。同変異体遺伝子群をDNaseIより断片化後、PCRを用いてアニーリング・増幅させることにより実際にシャフルされる結果を得、同システムの構築が完了した。一方、低温適応進化株の効率的検索を目的としたプレート上でのポジティプスクリーニング系の構築も試みたが、現在のところ高活性体ほど生育に阻害がかかる傾向が見られ、この問題を回避する工夫は将来に持ち越された。ついで、これまでのモデルとしてのサチライシンのほかに、同じく工業的にも環境的にも重要なα-アミラーゼも本研究のモデルとして取り上げ、同様の進化実験を試みたところ、低温適応α-アミラーゼ変異体の取得に成功した。これにより、本研究で扱ってきた実験室内進化システムは、対象をプロテアーゼに限定することなく、種々の有用酵素にも応用しうる汎用性のあることが最終的に示された。
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