オボトランスフエリンの殺菌ドメインの構造と機能に関する遺伝子工学的研究

1999 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 10660129
• 研究機関: 鹿児島大学
• 研究代表者: ヒッシャムR イブラヒム 鹿児島大学, 農学部, 講師 (90274836)
• キーワード: オボトランスフエリン / 殺菌ペプチド / コローニング / 遺伝子工学 / 構造 / 殺菌性 / トランスフエリン / 卵白タンパク質

研究概要

オボトランスフェリン(OTf)は卵白中の分子量80Kの糖タンパク質で、トランスフェリンと呼ばれる鉄結合タンパク質ファミリーの一員である。トランスフェリンファミリーはアミノ酸配列や三次構造が似ており、生物学的役割も似ているものと考えられ、ラクトフェリンには鉄結合性とは別に殺菌活性ドメインが存在することが明らかにされている。我々は先にOTfにも鉄結合に関係しない殺菌ドメインがN-ローブ中に存在することを証明し、OTAP92と命名した。この殺菌ドメインは、グラム陽性菌および陰性菌に対して殺菌作用を示すラクトフェリンやディフェンシンのそれと高い相同性があった。そこで本研究では、OTAP-92の殺菌機構を明らかにするために、遺伝子工学的手法を用いて研究を行った。昨年度の研究では輸卵管からOTfのmRNAを分離し、逆転写酵素プロトコールにしたがってOTfのcDNAを合成した。本年度は、OTfのN-およびC-ローブのcDNAを pT7Blueベクターヘクローニングすることに成功した。しかし、酵母発現系では発現しなかった。これはN-ローブにはポリA部位が、C-ローブにはシグナルペプチド部位が欠落していることによるものと思われた。このため、OTf cDNAのポリA部分をN-ローブcDNAの3'―末端側に挿入し、OTfのシグナルペプチドをコードする部分を、PCRと突然変異法によってC-ローブcDNAの5'-末端側に導入した。現在、酵母発現系(pYES2ベクター、INVSc1およびYNN27株)で発現を調べている。発現系が確立されたら、同じ方法でOTAP-92 DNAにポリAを導入し、発現試験を行う。次いで、SS結合に関与するシステイン部位の突然変異を行い、殺菌ドメインの殺菌機構におけるSS結合の役割を明らかにする予定ある。

研究成果

• [文献書誌] Ibrahim,H.R., Iwamori,E., Sugimoto,Y., Aoki,T.: "Identification of a distinct antibacterial domain within the N-lobe of ovotransferrin"Biochim.Biophys.Acta. 1401(3). 289-303 (1998)
• [文献書誌] Hatta,H.& Ibrahim,H.R.: "Anti-Microbial Substances in egg"Nutr.Health Life Science. 3(4). 18-25 (1998)
• [文献書誌] Arima,H., Kinoshita,T., Ibrahim,H.R., Azakami,H,, Kato,A.: "Enhanced secretion of hydrophobic peptide fused lysozyme by the introduction of N-glycosylation signal and the disruption of calnexin gene in Saccharomyces cerevisiae"FEBS Lett.. 440(1-2). 89-92 (1998)
• [文献書誌] Ibrahim,H.R.: "Ovotransferrin : Structure and Antimicrobial Function"Natural Food Antimicrobial Systems (Ed.A.s.Naidu),CRC Press Inc.FL,USA. 8(in press). (2000)
• [文献書誌] Ibrahim,H.R., Sugimoto,Y., Takayoshi,A., Naidu,N.: "Ovotransferrin Antimicrobial Peptide(OTAP-92)Kills Bacteria through Membrane Permeabilization Mechanism"Biochim.Biophys.Acta. (in press). (2000)
• [文献書誌] Ibrahim,H.R.: "Natual Food Antimicrobial Systems"CRC Press Inc.FL,USA. Chapter(8) (2000)