| 研究概要 |
1. エンド型イヌリナーゼはイヌリン内部のβ-2,1-フルクトフラノシド結合を切断し、イヌロオリゴ糖を生成する.昨年度、黒麹菌Aspergillus niger No.12株のゲノムDNAから2つの重複したエンド型イヌリナーゼ遺伝子inuAおよびinuBをそれぞれEcoRI断片としてクローニングし、構造解析を行った.これらの1,548bpのORFを含む断片にはいずれも約45bpの短い上流領域が存在するのみであった。今年度は、それぞれの遺伝子の上流領域のクローニングと構造解析を行った。制限酵素PstIで切断したゲノムDNAのライブラリー(pUC18)を作成した.本遺伝子に特異的なプローブを用いてコロニー・ハイブリダイゼーションを行い、inuA上流領域を含む断片1.8kbpと、inuB上流領域を含む断片1.6kbpをそれぞれインサートに持つクローンを得た.これらのシークエンスを解析した結果、inuA上流領域にはTATA boxならびにCCAAT boxに相当する配列が確認されたが、inuB上流領域にはCCAAT boxは認められなかった.また、本菌株の培養においてinuAおよびinuBのどちらの遺伝子が発現しているかについてRNAを単離して検討した.
2. エンド型イヌリナーゼ遺伝子をコードする遺伝子を新たに青カビの一種Penicillium sp.TN-88株のゲノムDNAから単離し、そのシークエンスを解析した。本酵素のN末端アミノ酸配列等を基に合成した2種のオリゴヌクレオチド(24mer)をプライマーとしてPCRでエンド型イヌリナーゼ遺伝子の一部(621bp)を増幅した.このPCR産物をジゴキシゲニンで標識し、本酵素遺伝子に特異的なプローブとした.種々の制限酵素で切断したゲノムDNAについてサザン・ハイブリダイゼーションを行った結果、3.0 kbp BamHI、7.0 kbp KpnIおよび8.0 kbp XbaI断片とそれぞれハイブリダイズした.このことはエンド型イヌリナーゼ遺伝子が本菌株のゲノムDNA上に1コピー存在するとを示唆した.ゲノムDNAライブリー(pUCl8)から本遺伝子を単離し、そのシークエンスを他の糸状菌起源の同遺伝子と比較した。
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