| 研究概要 |
電気穿孔法によりDNAをニワトリ胚に導入している。電気パルスの電圧の高さ、長さ、間隔、回数がどのくらいの時に最も良い効率が得られるかを検討した。25V,50msec,8回の電気インパルスで行うと心臓付近にDNAの入っていることが多かった。しかし効率良く入らない。電極の形状、太さ、露出部分、電極の間隔等が関係しているのではないかと思われる。われわれはニワトリ胚の心臓にDNAを導入する事を考えているので縫い針を電極にし、これを上から心臓を挟むようにしている。電極の間隔は8mm,露出部分は5mm程度、太さは1mmである。さらに電極を工夫して効率を上げたい。導入DNAはこれまでlacZ遁伝子の組み込まれたpmiwZを使っていた。この遺振子はニワトリのactinのプロモーターが組み込まれており、ニワトリに対して自然で、強力な発現ベクターである。しかしDNAの導入処理の後、固定と発色に2-3日かかる。早く結果を見たいのでDNAをpGFP系の物に換えている。これは発光くらげの遺伝子を組み込んだ発現ベクターであり、DNAが細胞に導入されると約1日後に、蛍光顕微鏡下で緑色の蛍光を発する。実験結果の確認期間の短縮に大いに役立っている。ただしこの蛍光はやがて減衰してしまうので、くわしい観察にはpmiwZを用い、この2種類の発現ベクターで初期的研究を続ける計画である。電気穿孔法により心臓付近にDNAが入ったのは確認できたが、心筋層に入ったのか表面の膜に入ったのか不明である。パラフィン切片などでさらに詳しく検討したい。
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