ラスがん遺伝子とイノシトール四リン酸で駆動されるCa^<2+>流入チャネルとの機能相関

1998 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 10670038
• 研究機関: 金沢大学
• 研究代表者: 橋井 美奈子 金沢大学, 医学部, 講師 (10272957)
• 研究分担者: 星 直人 金沢大学, 医学部, 助手 (90229170) ; 横山 茂 金沢大学, 医学部, 助教授 (00210633) ; 東田 陽博 金沢大学, 医学部, 教授 (30093066)
• キーワード: ラス / Caオシレーション / イノシトール4リン酸 / InsP4 / Ras-GAP / 受動体作動性Ca流入 / ブラジキニン / アンチセンス

研究概要

私たちは、がん化した変異ラスにより異常に活性化される受動体作働性Ca^<2+>流入経路を、特にIP4受容体(=ラス特異的GTPase活性化タンパク質,Ras-GAP)にターゲットをあて具体的に調査している。
Antisense RAS-GAP^<IP4 結合蛋白> cDNAによる、ラスがん細胞IP4受容体ノックダウン効果
i) Ras-GAP発現抑制DT細胞作成-Transient導入:マウスRas-GAP^<IP4BP>cDNAの1kbのフラグメントを逆方向にベクター(蛍光用GFPタグを持つpTracer-SV40)へ組み込み、変異v-Ki-rasを発現したNIH/3T3線維芽細胞(DT)へsuperfectにより導入。Stable株作成:同cDNAの1kbのフラグメントを逆向きでpcDNA3ベクターへ組み込み、ゼオシンで2週間以上選択して生存細胞20クローンを得た。方向性は制限酵素切断とPCRにて確認した。
ii) 内因性Ras-GAP^<IP4BP>mRNAの発現抑制の確認-Stable株クローンからtotal RNAを得、18SrRNAを内部指標としてノーザンブロットで実験、発現抑制を確認した。
iii) Caオシレーションへの阻害効果-細胞内Ca濃度画像で調べる「浜ホトArgus50」。1画面中、Anti-RasGAP(+)のGFP蛍光で染まるTransient導入細胞では、GFP蛍光で染まらない対照細胞に比し、ブラジキニンによるCaオシレーションの頻度減少、あるいは消失が見られた。

研究成果

• [文献書誌] Higashida, H.et al.: "Endomorphins inhibit high-threshold Ca^<2+> channel currents in rodent NG108-15 cells overexpressing μ-opioid receptors." J.Physiol.(London). 507. 71-75 (1998)
• [文献書誌] Furukawa, T.et al.: "Differential interactions of the C terminus and the cytoplasmic I-II loop of neuronal Ca^<2+> channels with G-protein α and βγ subunits." J.Biol.Chem.273. 17595-17603 (1998)
• [文献書誌] Hoshi, N.et al.: "KCR1: a membrane protein that facilitates functional expression of non-inactivating K^+ currents associates with rat EAG voltage-dependent K^+ channels." J.Biol.Chem.273. 23080-23085 (1998)