ホヤ胚2細胞系をもちいた神経分化過程における時間制御の解析

1999 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 10670049
• 研究機関: 明治薬科大学
• 研究代表者: 高橋 國太郎 明治薬科大学, 薬学部, 教授 (10010034)
• 研究分担者: 田中 資子 明治薬科大学, 薬学部, 講師 (80277730)
• キーワード: ホヤ初期胚 / 新神経誘導系 / 三細胞系 / 内向き整流性K+チャネル / ゲノムライブラリー / 五'端領域 / GFP / レポータ遺伝子

研究概要

本研究計画では、ホヤ4乃至8細胞胚から分離した予定神経割球・予定脊索割球からなる神経誘導二つあるいは三細胞系を用いた。予定神経細胞内における、(1)bFGF受容体型チロシンキナーゼの出現による神経分化への被誘導能獲得時期の制御機序、(2)誘導信号による初期表皮形質内向き整流性K+チャネル(TuIRKAチャネル)の転写の制御による神経細胞への分化決定の時期制御機序、(3)チロシンキナーゼ下流に存在するセリン・スレオニン蛋白キナーゼ活性化によるギャップ結合の消失に連動する電位依存性チャンネルの膜への発現時期の制御機序、を解析する。そして、初期誘導時点での時間制御は燐酸化カスケードのもつ時計作用であり、ギャップ結合の示す時間制御機能はCa波の進入による膜へのチャネル出現の制御ではないかという仮説にたって、神経細胞分化過程における基本時間制御機構を明らかにする。
ホヤ4細胞胚前方割球A3に8細胞胚前方割球a4-2またはA4-1割球を接着後培養すると接着および培養条件により表皮または神経細胞に分化する新しい神経誘導系を見出した。この新しい誘導系をTuIRKAチャンネル遺伝子のプロモーターを利用した発現系とするために(a)胚細胞の表皮、神経分化の条件を検討した。(b)内因性のTuIRKAの発生における発現量を電気生理学的に定量した。(c)マボヤゲノムDNAライブラリイから内向き整流性K(IRK)チャネル遺伝子のクローンが得られ、制限酵素地図を作成した結果、すべての蛋白質コード領域と5'端転写制御領域が見出された。この領域に、レポータGFP遺伝子を結合し、表皮細胞での初期転写活性を確認した。この領域にGFPギャップ結合融合蛋白遺伝子を連結したクローンを作成した。今後はこれを初期外胚葉細胞に強制発現し、Naチャネルの細胞膜への出現を制御する予定である。

研究成果

• [文献書誌] TANAKA-K,M.,Yoshihara,R.&Takahashi,K.: "The expression of MyoD-GFP fusion protein converts fibroblasts to myoblasts."Japanese Journal of Physiology. 49 Suppl. in press (1999)
• [文献書誌] TANAKA-K,M.,&Takahashi,K.: "New neural Induction in ascidian ectodermal blastomeres."Neuroscience Research. 23 Suppl. S143 (1999)
• [文献書誌] Takahashi,K.& TANAKA-K,M.: "Monitoring early neuronal differentiation by ion channels in ascidian embryos."Journal of Neurobiology. 36. 3-22 (1998)
• [文献書誌] 田中資子,高橋國太郎: "発生と疾患におけるギャップ結合チャンネル"神経研究の進歩. 42. 348-357 (1998)
• [文献書誌] Inazawa,T., Okamura,Y.&TAKAHASHI,K.: "Basic fibroblast growth factor induction of neuronal ion channel expression in ascidian ectodermal blastomeres."Journal of PhysioIogy(London). 511. 347-359 (1998)
• [文献書誌] TAKAHASHI,K.&Okamura,Y: "Ion channels and early development of neural cells."Physiological Reviews. 78. 307-337 (1998)