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本研究計画では、ホヤ4乃至8細胞胚から分離した予定神経割球・予定脊索割球からなる神経誘導二あるいは三細胞系を用いた。予定神経細胞内における、(1)bFGF受容体型チロシンキナーゼの出現による神経分化への被誘導能獲得時期の制御機序、(2)誘導信号による初期表皮形質内向き整流性K+チャネル(TuIRKAチャネル)の転写の抑制による神経細胞への分化決定の時期制御機序、(3)チロシンキナーゼ下流に存在するセリン・スレオニン蛋白キナーゼ活性化によるギャップ結合の消失に連動する電位依存性チャネルの膜への発現時期の制御機序、を解析する。そして、初期誘導時点での時間制御は燐酸化カスケードのもつ時計作用であり、ギャップ結合の示す時間制御機能はCa波の進入による膜へのチャネル出現の抑制ではないかという仮設にたって、神経細胞分化過程における基本時間制御機構を明らかにする。
ホヤ4細胞胚前方割球A3に8細胞胚前方割球a4-2またはA4-1割球を接着後培養すると接着および培養条件により表皮または神経細胞に分化する新しい神経誘導系を見出した。この新しい誘導系をTuIRKAチャネル遺伝子のプロモーターを利用した発現系とするために(a)肺細胞の表皮、神経分化の条件を検討した。(b)内因性のTuIRKAの発生における発現量を電気生理学的に定量した。(c)マボヤゲノムDNAライブラリイから内向き整流性K(IRK)チャネル遺伝子のクローンが得られ、制限酵素地図を作成した結果、すべての蛋白質コード領域と5'端転写制御領域が見出された。この領域に、レポータGFP遺伝子を結合し、表皮細胞での初期転写活性を確認した。この領域にGFPギャップ結合融合蛋白遺伝子を連結したクローンを作成した。今後はこれを初期外胚葉細胞に強制発現し、Naチャネルの細胞膜への出現を制御する予定である。
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