| 研究概要 |
目的:ユビキチン結合酵素UBC9(UBE21)は特異的転写因子MITF(Microphthalmia-associated Transcription Factor)と相互作用を有する。MITFの異常はWaardenburg症候群型を引き起こす。今回、リボザイムによるUBC9遺伝子の発現制御系とUBC9ゲノム遺伝子破壊法を用いたUBC9の機能解明を目指し以下の研究を行った。
結果:(1)リボザイムによるUBC9遺伝子の発現制御;マウスUBC9-mRNAに対する特異的ハンマーヘッド型リボザイムRZ-m329、RZ-m401,RZ-m620の発現プラスミドを構築した。in vitro transcription法でマウスUBC9-mRNAおよびリボザイムを作製し、これらのリボザイムがマウスUBC9-mRNAを切断することを確認した。次に、mUBC9とLuciferaseを結合した。レポーターとリボザイム発現プラスミドを用いたレポーターアッセイで、培養細胞においてもRZ-m401が比較的効率よくマウスUBC9-mRNA発現を低下させることが確認できた(投稿準備中)。更に、MITFとGFP(Green Fluorescent Protein)の融合蛋白発現ベクターを構築した。現在、MITF-GFP発現ベクターとリボザイム発現ベクターの培養細胞への遺伝子導入実験にて、MITF機能に及ぼすUBC9作用を解析中である(発表準備中)。(2)ヒトおよびマウスUBC9遺伝子の単離と構造解析;P1ファージライブラリーよヒトおよびマウスUBC9遺伝子を含むクローンhUBC9-P1、mUBC9-P1をクローニングした。ヒトUBC9遺伝子は、7つのエクソンから構成され、プロモーターはTATA-BoxがなくGC-richで、そのプロモーター活性は転写開始転から上流約1kbにより規定されることを明らかとした(投稿中)。また、マウスUBC9遺伝子も7つのエクソンから構成されることを確認した。更にマウスUBC9ノックアウトマウスの作製を目指してターゲッティングベクターを作製中である。
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