ε型Cキナーゼの細胞内生理的基質の同定と機能の解析

1998 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 10670130
• 研究機関: (財)東京都臨床医学総合研究所
• 研究代表者: 秋田 朗子 財団法人 東京都臨床医学総合研究所, 遺伝情報研究部門, 研究員 (40124432)
• 研究分担者: 川崎 博史 横浜市立大学, 木原研, 助教授 (70169704) ; 矢島 由紀子 財団法人 東京都臨床医学総合研究所, 遺伝情報研究部門, 研究員 (60090114)
• キーワード: プロテインキナーゼC / ホルモン / ホルボールエステル / MARCKS / リン酸化 / thyrotropin-releasing hormone / 中間径線維 / 分泌

研究概要

プロテインキナーゼC(PKC)は、種々の生理活性物質の分泌や、細胞増殖、分化、細胞死に深く関与している。その制御の狂いは、癌やアレルギー等の様々な現代病を引き起こすことから、PKC分子種レベルにおける細胞内情報伝達機構の解明は急務である。しかし、未だ個々の分子種の役割やその作用点については殆ど不明である。我々は、ラット下垂体由来のGH細胞において、PKC εが視床下部ホルモンのTRH(throtropin-releasing hormone)によるプロラクチン(PRL)分泌調節に必須の役割を果たすことを既に明らかにした。本研究は、この細胞をモデル系として、生理的刺激によるPKC εの分子作用機構を明らかにすることを目的として開始した。
本年度は、in vivoラベルしたリン酸化蛋白質について二次元電気泳動法により解析し、PKC εの基質を探索した。その結果、TRH刺激でリン酸化レベルが上昇する蛋白質のうち、分子量約80kD(PI;4.3)、52kD(PI;5.6-5.75)、19kD(PI;5.5-5.6)のリン酸化がPKC活性化剤のTPA刺激によって増大し、且つ、PKC阻害剤で抑制された。80kDと19kDの分子は、酸や熱に対する耐性等の生化学的特性から、各々MARCKSとstathminであることが推定された。他方、52kD分子は、ペプチドマップ、アミノ酸部分配列、イムノプロット等の解析により中間径繊維物質(IF)であることが判明した。MARCKSと1Fのリン酸化の経時変化は、PKC εの活性化とPRL分泌増大とよく一致し、更にこれらはPKC εの強制高発現株で亢進していた。他方、stathminに関しては一致しなかった。以上の結果から、MARCKSとIFがPKC εの生理的基質であり、これらが構成するアクチン系と中間径繊維の各々独立した細胞骨格構造が、調節性ホルモン分泌過程に重要な役割を果たすことが強く示唆された。

研究成果

• [文献書誌] Akita,Y.et.al.: "Involvement of protein kinase C ε in thyrotropin-releasing hormone-stimulated phosphorylation of MARCKS and keratin in rat pituitary clonal cells." Electrophoresis. (in press).
• [文献書誌] Suzuki,N.et.al.: "Calpastatin is up-regulated by both the transcriptional and the posttranslational level by PKC pathway on TRH stimulation of GH_4C_1 cells." APSN. (in press).
• [文献書誌] Osaka,F.,et.al.: "A new NEDD8-ligating system for cullin-4A." Genes & Dev.12. 2263-2268 (1998)
• [文献書誌] Kawakami,A.et.al.: "Pseudohypoparathyroidism,visceral fat accumulation and type 2 diabetes mellitus." Diabetes Care. (in press).
• [文献書誌] Yajima,Y.et.al.: "VIP induces the translocation and degradation of the α subunit of G_S protein in rat pituitary GH_4C_1 cells." J.Biochem.123. 1024-1030 (1998)
• [文献書誌] Suzuki,N.et.al.: "Regulation of calpastatin by both the transcriptional and the post-translational level by PKC pathway upon TRH stimulation of GH_4C_1 cells." The Thirteenth Rinshoken International Conference:Ubiquitin and Proteasome.13. 139-140 (1998)
• [文献書誌] Kawasaki,H.et.al.: "Classification and evolution of EF-hand proteins." BioMetals(in press),