| 研究課題/領域番号 |
10670132
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| 研究機関 | 千葉大学 |
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研究代表者 |
幡野 雅彦 千葉大学, 大学院・医学研究科, 助教授 (20208523)
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| 研究分担者 |
岡田 誠治 千葉大学, 大学院・医学研究科, 助手 (50282455)
徳久 剛史 千葉大学, 大学院・医学研究科, 教授 (20134364)
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| キーワード | Ncx / 遺伝子発現調節 / 神経堤細胞 / ヒルシュスプルング病類縁疾患 / 疾患モデル動物 |
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| 研究概要 |
NcxKOマウスは生後約2〜3週令で巨大結腸症を発症し死亡する。このKOマウスでは腸管神経節神経細胞が存在し、しかもその数は増加しておりヒトのヒルシュスプルング病類縁疾患の一つであるNeuronal Intestinal Dysplasia(NID)と類似している。ヒトNCX遺伝子の構造と発現調節機構およびヒルシュスブルング病類縁疾患患者におけるNCX遺伝子異常を明らかにすることを目的とし、以下の研究成果を得た。
1. ヒトNCX遺伝子(cDNAおよびgenomic DNA)を単離しそのイントロン、エクソンを決定した。マウスと同様3つのエクソンよりなりホメオドメインは100%ヒト、マウス でアミノ酸配列が一致していた。
2. マウスおよびヒトNCX遺伝子の翻訳開始コドンより上流のゲノムDNAをファージライ ブラリーから単離し、塩基配列を決定しさらにprimer extention法にて転写開始点を決定した。5′領域の種々のdeletion cloneを作製し、luciferase reporter geneにつないでプロモーター活性を測定しプロモーター領域を決定した。プロモーター領域にはTATAbox, CAAT boxなどの配列は存在しなかった。
3. Repoter geneを神経芽細胞腫細胞株およびそれ以外の細胞株に遺伝子導入し、Ncx遺伝子の発現の組織特異性を調節する領域20bpを決定した。この部分はヒトおよびマウスで塩基配列が保存されており神経芽細胞腫細胞株においてはゲルシフト法にてこの領域の DNAと結合する核蛋白質の存在が示唆された。
4. ヒトNCX遺伝子の変異を調べる目的でそれぞれのエクソンをはさむようなプライマーを作製し、SSCP-PCR法を確立した。そしてヒトNID患者末梢血よりDNAを分離しSSCP-PCR法にて変異を調べた。これまで11サンプルを検討したがいずれもsilent mutationで アミノ酸の変異は見つからなかった。
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