生細胞におけるギャップ結合の構造と機能のリアルタイム同期解析

1998 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 10670214
• 研究機関: 京都府立医科大学
• 研究代表者: 小山田 正人 京都府立医科大学, 医学部, 助教授 (30183255)
• キーワード: 細胞間コミュニケーション / ギャップ結合 / コネキシン / GFP / 共焦点レーザ顕微鏡 / マイクロインジェクション / Hela細胞

研究概要

ギャップ結合蛋白質(コネキシン)のひとつであるコネキシン43(Cx43)遺伝子のコーディング領域のC末にオワンクラゲのgreen fluorescent protein(GFP)をつなぎ、コネキシンGFP融合蛋白質を培養細胞に発現させることにより、生細胞におけるコネキシンの局在の可視化に成功した。
すなわち、Cx43-GFP発現ベクターを、コネキシン蛋白をほとんど発現しておらず、ギャップ結合細胞間コミュニケーション能が非常に低いヒト子宮頚癌細胞株HeLa細胞にトランスフェクションし、G418によってtransfectantを選択した。コントロールとして、コネキシン遺伝子を持たないEGFP-C1 vectorをトランスフェクトしたHeLa細胞株も樹立した。画像は、共焦点レーザ顕微鏡を用いてデジタルデータとして記録した。
Cx43-GFP融合蛋白質を発現されたHeLa細胞では、融合蛋白質は細胞膜に線状あるいは点状、斑状に局在を示した。ethidium bromideの単一細胞へのmicroinjectionによって、色素は隣接する細胞に移行し、導入されたconnexin-GFP融合蛋白質が機能的ギャップ結合を形成できることが示された。同一視野での局在を時間経過とともに観察すると、細胞質内の小胞が細胞膜に融合する像が得られた。Cx43-GFP融合遺伝子発現ベクターと共焦点レーザ顕微鏡を用いたこの研究により、生細胞におけるギャップ結合の局在のリアルタイムでの可視化が可能となった。

研究成果

• [文献書誌] Oyamada, M., et al.: "Gap junctions in health and disease." Med.Electron Microsc.31. 115-120 (1998)
• [文献書誌] Masuda, A., Oyamada, M. et al.: "Regulation of cytosol-nucleus pH gradients by K+/H+exchange mechanism in the nuclear envelope of neonatal rat astorcytes." Brain Res.807. 70-77 (1998)
• [文献書誌] 小松磨史、小山田正人、他: "分散培養を用いたEmbryonic stem(ES)cellのin vitro神経分化とギャップ結合細胞間コミュニケーションの研究." 札幌医学雑誌. 67. 11-22 (1998)
• [文献書誌] 横山慶一,小山田正人 他: "心筋におけるカルシウム波" 細胞. 30. 15-18 (1998)
• [文献書誌] 松下努,小山田正人 他: "心筋梗塞における残存心筋の反応" 循環器科. 43. 266-268 (1998)
• [文献書誌] 高松哲郎,小山田正人: "共焦点顕微鏡" 病理と臨床. 16. 593-597 (1998)
• [文献書誌] Oyamada, M. et al.: "Roles of connexin genes in cell differentiation and carcinogenesis.In : N.Kuzumaki(ed.)Cytoskeleton and G-proteins in the regulation of cancer" Hokkaido University Press, 184 (1998)
• [文献書誌] Oyamada, M. et al: "Connexin expression during in vitro cardiac differentiation of mouse embryonic stem cells.In : R.Werner(ed.)Gap junctions," IOS press, 385 (1998)