生細胞におけるギャップ結合の構造と機能のリアルタイム同時解析

1999 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 10670214
• 研究機関: 京都府立医科大学
• 研究代表者: 小山田 正人 京都府立医科大学, 医学部, 助教授 (30183255)
• キーワード: 細胞間コミュニケーション / ギャップ結合 / コネキシン / green fluorescent protein / 共焦点レーザ顕微鏡 / カルシウムイメージング

研究概要

1.ギャップ結合蛋白質(コネキシン)の生細胞における局在の可視化
コネキシン43(Cx43)遺伝子のコーディング領域のC末にオワンクラゲのgreen fluorescent protein(GFP)をつなぎ、コネキシンGFP融合蛋白質を培養細胞に発現させることにより、生細胞におけるコネキシンの局在の可視化に成功した。Cx43-GFP融合蛋白質を発現させたHeLa細胞では、融合蛋白質は細胞膜に線状あるいは点状、斑状に局在を示した。ethidium bromideの単一細胞へのmicroinjectionによって、色素は隣接する細胞に移行し、導入されたconnexin-GFP融合蛋白質が機能的ギャップ結合を形成できることが示された。同一視野での局在を時間経過とともに観察すると、細胞質内の小胞が細胞膜に融合する像が得られた。
2.コネキシンの局在と細胞内カルシウムイオンのリアルタイム同時可視化
Cx43-GFP及びCx40-GFP融合蛋白の発現ベクターを作成し、新生仔ラット初代培養心筋細胞に導入後、Fura Redを用いることで、細胞内カルシウムの変化をコネキシン-GFPと同時に可視化することに成功した。
3.Dominant-negativeCx43-GFP融合蛋白質発現ベクターによるギャップ結合コミュニケーションの阻害
Cx43遺伝子に突然変異を導入することにより、野生型Cx43の機能を阻害するdominant negative変異Cx43遺伝子にGFP遺伝子を融合し、dominant negativeCx43-GFP融合蛋白発現ベクターを作成した。もともと野生型Cx43を発現しギャップ結合細胞間コミュニケーション機能の高い肝上皮細胞株IAR20細胞に導入することによって、野生型Cx43の機能を阻害することを確認した。このdominant negativeCx43-GFP融合蛋白発現ベクターは、細胞集団の特定の細胞のみのギャップ結合機能を特異的に阻害することを可能にするもので、ギャップ結合の生細胞における機能を解析する上で非常に有効なツールとなる。

研究成果

• [文献書誌] 小山田正人 他: "生細胞におけるギャップ結合の構造と機能の同時解析-GFP融合遺伝子、蛍光プローブと共焦点レーザ顕微鏡を用いて-"レーザ顕微鏡研究会第21回講演会論文集. 50-53 (1998)
• [文献書誌] 小松磨史、小山田正人 他: "分散培養を用いたEmbryonic stem(ES)cellのin vitro神経分化とギャップ結合細胞間コミュニケーションの研究"札幌医学雑誌. 67. 11-22 (1998)
• [文献書誌] Oyamada,M.,et al.: "Gap junctions in health and disease"Medical Electron Microscopy. 31. 115-120 (1998)
• [文献書誌] 横山慶一、小山田正人 他: "心筋におけるカルシウム波"細胞. 30. 15-18 (1998)
• [文献書誌] 小山田正人 他: "共焦点顕微鏡の扱い方"検査と技術. 27-13. 1495-1501 (1999)
• [文献書誌] 小山田正人 他: "GFPによる生物現象のリアルタイムイメージング"細胞. 31. 280-284 (1999)
• [文献書誌] Masuda A,Oyamada,M.,et al.: "Regulation of cytosol-nucleus pH gradients by K+/H+ exchange mechanism in the nuclear envelope of neonatal rat astrocytes"Brain Res. 807. 70-77 (1998)
• [文献書誌] Nagaoka T,Oyamada,M.,et al.: "Differential Expression of Gap Junction Proteins Connexin26,32,and 43 in Normal and Crush-injured Rat Sciatic Nerves. Close relationship between connexin43 and occludin in the perineurium"J Histochem Cytochem. 47. 937-948 (1999)
• [文献書誌] Matsushita T,Oyamada,M.,et al.: "Formation of cell junctions between grafted and host cardiomyocytes at the border zone of rat myocardial infarction"Circulation. 10. II262-II268 (1999)
• [文献書誌] Matsushita T,Oyamada,M.,et al.: "Remodeling of Cell-Cell and Cell-Extracellular Matrix Interactions at the Border Zone of Rat Myocardial Infarcts"Circ Res. 85. 1046-1055 (1999)
• [文献書誌] Oyamada,M.,et al.: "In vitro cardiomyocytic differentiation of mouse embryonic stem cells deficient in gap junction protein connexin 43"Cardiac and vasucular regeneration. 1(in press). (2000)
• [文献書誌] 小山田正人 他: "ギャップ結合と疾患"病理と臨床. 18(in press). (2000)
• [文献書誌] Fujita K,Oyamada,M.,et al.: "Real-time imaging of two-photon-induced fluorescence with a microlens-array scanner and a regenerative amplifier"J Microsc. 194. 528-531 (1999)
• [文献書誌] Fujita K,Oyamada,M.,et al.: "Confocal multipoint multiphoton excitation microscope with microlens and pinhole arrays"Opt Comm. 174. 7-12 (2000)
• [文献書誌] Ogawa H,Oyamada,M.,et al.: "Gap junctions and phosphorylation of connexin43 in mouse preimplantation embryos"Mol Rep Dev. 55. 393-398 (2000)
• [文献書誌] Oyamada,M.,et al.: "Gap junctions"IOS press Omsha,Amsterdam,Netherlands. 385 (1998)
• [文献書誌] Oyamada,M.,et al.: "Cytoskeleton and G-proteins in regulation of cncer"Hokkaido university school of medicine,Sapporo,Japan. 184 (1998)