| 研究課題/領域番号 |
10670244
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
寄生虫学(含医用動物学)
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| 研究機関 | 久留米大学 |
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研究代表者 |
福間 利英 久留米大学, 医学部, 教授 (90125146)
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| 研究分担者 |
原 樹 久留米大学, 医学部, 助手 (30238159)
江下 優樹 大分医科大学, 医学部, 助教授 (10082223)
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| 研究期間 (年度) |
1998 – 1999
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| キーワード | Trypanosoma brucei / エピソマールプラスミドベクター / 自律複製シグナル / ミニサークル / パーティクルデリバリー / 遺伝子導入 / 血流型 / 変換体選択 |
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| 研究概要 |
Trypanosoma bruceiのプロサイクリック型原虫では、外来遺伝子の導入は比較的効率良く行えるのに対して、血流型原虫への導入は可能ではあるものの非常に困難であった。そこで、パーティクルデリバリーを用いることで、従来の電気穿孔法より飛躍的に効率良く血流型原虫に外来遺伝子を導入することに成功した。次に、レポーターとして用いるGFPの発現を試みた結果、プロサイクリック型原虫では強い蛍光を発するものの、野生型GFPの持つ温度感受性(37℃では翻訳後修飾が正常に進行しない)の性質から血流型原虫では蛍光を観察できなかった。そこで、変異型GFPを用いて検討した結果、EGFPが血流型原虫でも強い蛍光を発することが判った。一方、各発育ステージで特異的に発現する遺伝子をクローニングする目的で、血流型およびプロサイクリック型のいずれでも発現できるエピソーマルなプラスミドベクターを構築することを試みたが、思いがけなく高い頻度でクロモゾームに入ってしまうことが判明し、原因を解析中である。次に、ネオマイシン耐性遺伝子導入血流型原虫の選択培養の改善を試みた結果、U底96穴プレートによる段階希釈法を用いることで耐性細胞を得ることに成功したが、耐性細胞を獲得できる効率が非常に悪い上、2ヶ月近くの期間を要する。そこで、フレオマイシン耐性遺伝子を導入した血流型原虫の選択にマウスを用いたin vivo薬剤選択系による耐性細胞の獲得を試みた結果、1〜2週間の短期間で効率良く薬剤耐性血流型原虫を獲得できた。
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