電子分光顕微鏡を用いた孔形成細胞溶解毒素による生体膜傷害機構の超微細形態的解析

1998 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 10670270
• 研究機関: 北里大学
• 研究代表者: 関矢 加智子 北里大学, 薬学部, 講師 (30050579)
• 研究分担者: 二重作 豊 北里大学, 医療衛生学部, 教授 (50014197)
• キーワード: ストレプトリジンO / 細胞溶解毒素 / 電子分光顕微鏡 / 孔形成毒素 / ネガティブ染色 / 溶血機構 / リポソーム / チオール活性化毒素

研究概要

当該研究は、細菌が産生する孔形成細胞溶解毒素による生体膜傷害機構を電子分光顕微鏡を用いて、超微細形態的に解析することを目的としている。
1. 平成10年度の研究実施計画として、まず、試料支持膜の開発が上げられていたが、一酸化ケイ素(SiO)からの炭素を含まない支持膜の作成に成功した。
2. さらに、この膜に大腸菌の凍結超薄切片を載せても破れることなく、電子線照射にも耐え、電子分光顕微鏡で観察したところ、菌の全体像を捕えることができた。しかも、その粒状性は、たんぱく分子の観察に支障が無い程度に細かいものであった。このような成果から、代表的な孔形成細胞溶解毒素であるチオール活性化毒素がリポソーム上に会合して形成するリング状構造、その会合状態、あるいは毒素分子そのものを無染色で観察できる可能性が非常に高まった。
3. 電子分光顕微鏡観察像は、画像情報をデジタル化し、コンピューター解析も行っている。
4. 次に、これらの毒素の生体膜への結合の標的と考えられているコレステロールの役割をより明確にするために、従来の卵黄フォスファチジルコリンを合成品に替えてリポソームを作成することを試み、解析可能な合成フォスファチジルコリンの材料の選択とリポソームの作成条件が定められた。
以上、本年度予定の研究計画をほぼ達成し、今後、上記のリポソームを用いて、新たな手法として膜クランプ法を導入し、リング形成に対するコレステロールの関与や毒素分子の膜への結合および毒素分子の膜内の移動の状況などの解析を行う予定で実験続行中である。

研究成果

• [文献書誌] Kachiko Sekiya: "Formation of Ring-shaped Structures on Erythrocyte Membranes after Treatment with Botulinolysin, a Thiol-Activated Hemolysin from Clostridium botulinum." Infect.Immun.66・6. 2987-2990 (1998)
• [文献書誌] Kachiko Sekiya: "Review:Characterization of the Damage to Membranes Caused by Bacterial Cytolysins" J.Electron Microscopy. 47・6. 543-552 (1998)
• [文献書誌] Yutaka Futaesaku: "Review Article : Principles of Electron Spectroscopic Imaging (ESI) in Hard Tissue Biology." J.Hard Tissue Biology. 7・1. 1-10 (1998)
• [文献書誌] Kachiko Sekiya: "Formation of Ring-shaped Structures on Erythrocyte Membranes upon Treatment with Botulinolysin, a Thiol-Activated Hemolysin from Clostridium botulinum." Electron Microscopy ICEM 14 Symposium SS. IV. 755-756 (1998)
• [文献書誌] Yutaka Futaesaku: "Development of Non-Carbon Support films for Electron Spectroscopic Imaging (ESI) in Biology." Cellular and Molecular Biology. Suppl.(予定). (1999)
• [文献書誌] Yutaka Futaesaku: "Non Carbon Supporting Films for Electron Spectroscopic Imaging (ESI) -Application for Biological Specimens and Ultracryosections-" Electron Microscopy ICEM 14 Symposium SS. I. 699-700 (1998)