マイクロサテライトの同一個体内での不均一性とDNA鑑定に及ぼす影響

1998 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 10670402
• 研究機関: 東京医科大学
• 研究代表者: 小林 了 東京医科大学, 医学部, 助手 (40146775)
• 研究分担者: 水野 文雄 東京医科大学, 医学部, 教授 (50001904) ; 平井 莞二 東京医科歯科大学, 難研, 教授 (00100991) ; 伊藤 幸夫 順天堂大学, 医学部, 講師 (70053345)
• キーワード: マイクロサテライト / PCR / 個人識別 / DNA / 口蓋扁桃 / TH01

研究概要

マイクロサテライトの多様な多型性はその変異のしやすさによるところが大きく、細胞のDNA複製過程におけるスリッページが原因と考えられている。これまで法医学領域では、DNAマーカーはアレル数、ヘテロ接合度、マーカーとしての安定性および集団の中での排除率に重点がおかれて選択されてきたが、同一個体内でマイクロサテライトに多型性が存在するかどうかは検討されていなかった。本研究では、同一個体内でマイクロサテライトの型が一致しているかどうかを検定し、それが法医鑑定に及ぼす影響を検討した。
本年度は、同一個体内におけるマイクロサテライトの不均一性を検討するために、マイクロサテライトとして現在鑑定に用いられているTH01座位を選択し、その型が体細胞1個からでも判定できるようsingle cell-PCR法を確立することを目標とした。TH01型判定に用いるヒトの体細胞として、細胞分裂を繰り返している臓器のひとつであるヒトの口蓋扁挑由来の細胞を用いた。慢性扁桃炎患者10人より摘出した左右20例の口蓋扁桃を、スパーテルで押しつぶして細胞を遊離させた後、フィコールを用いた比重密度勾配遠心法によって単核球を分離した。
これらの細胞を使ったsingle cell-PCR法では、限界希釈によって単核球をPCR反応用のチューブ1つにつき1個まき、KOHで溶解してDNAを溶出しHClで中和後反応用bufferを加え、1stroundおよび2nd roundとも94℃で45秒、60℃で30秒、72℃で30秒でそれぞれ30サイクルおよび50サイクル増幅した。プライマーの5'末端に^<32>Pで標識し、8M尿素を含むシーケンスゲルで電気泳動することにより、正確な型判定をすることができた。また、マーカーとしてM13mp18のシーケンスラダーを使用することにより、1bpの違いも識別することができた。

研究成果

• [文献書誌] Hirai,K.: "Epstein-Barr virus genome in infected cells and cancer." Gann Monograph on Cancer Research. 45. 29-39 (1998)
• [文献書誌] Kobayashi,R.: "Detection of Epstein-Barr virus infection in the epithelial cells and lymphocytes of non-neoplastic tonsils by in situ hybridization and in situ PCR" Arch Virol. 143. 803-813 (1998)
• [文献書誌] Kobayashi,R.: "Comparative analysis of ABO typing by bothserological and DNA analyses from highly putrefied semen," Prog Fores Genet. 7. 103-105 (1998)
• [文献書誌] Itoh,Y.: "DNA analyses of ABO blood group variants,A3,Aend,and Bm" Prog Fores Genet. 7. 204-206 (1998)
• [文献書誌] 小林 了: "DIS80にみられた42以上型の解析" DNA多型. 6. 90-94 (1998)
• [文献書誌] 佐藤耕一: "Primer extension preamplification(PEP)法を用いたDNA型判定について -型判定の正確さと検出限界の検討-" 日法医誌. 52. 184-190 (1998)