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I 材料の採取
野生型雌性NODマウスを週齢別および糖尿病発症の有無により分類し、膵臓を摘出した。この膵臓を用いて凍結切片を作成した。対照群として同週齢の雌性ICRマウスを用いた。
II 膵組織切片からの膵島およびリンパ球の切断と収集およびmRNA抽出
膵組織切片をのせたスライドグラスを倒立顕微鏡に設置し、3次元マイクロマニュプレーターを操作し、極めて細いガラス針で目的とする膵β細胞または膵島浸潤リンパ球の単個細胞を切断、収集した。さらにmRNA抽出キットを用いてmRNAを抽出した。
IIIアポトーシス誘導の解析
1. IIより得た膵島浸潤リンパ球のmRNAを用いて、RT-PCR法にて各種サイトカイン、FasL、PerforinおよびGranzyme等のアポトーシスを誘導する因子のmRNAレベルでの発現を測定中である。
2. IIより得た膵島のmRNAを用いて、RT-PCR法にてFas、TNF-receptor familyおよびiNOS等の浸潤リンパ球より誘導されるアポトーシス関連因子のmRNAレベルでの発現を測定中である。
IV アポトーシスによる破壊の解析
IIより得た膵島のmRNAを用いて、RT-PCR怯を用いて、アポトーシスシグナル伝達物質であるICE subfamily.CPP32subfanmilyおよびアポトーシス関連蛋白であるBcl-2familyのmRNAレベルでの発現を測定中である。
以上のように現在はまだ材料採取が終了し、その解析を始めたところである。
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