肝細胞膜上に局在するトランスポーター分子の細胞内移送機構の解析

1998 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 10670508
• 研究機関: 東海大学
• 研究代表者: 加川 建弘 東海大学, 医学部, 講師 (30245469)
• 研究分担者: 西崎 泰弘 東海大学, 医学部, 講師 (80237693) ; 渡辺 勲史 東海大学, 医学部, 助教授 (90167156)
• キーワード: P-glycoprotein / multidrug resistance / green fluorescent protein / sorting / 肝細胞

研究概要

肝細胞のcanalicular membraneに局在するP-glycoprotein(multidrugresistance1,MDR1)の細胞内移送機構を解析するため、P-glycoproteinとgreenfluorescent protein(GFP)を融合蛋白として発現するベクターの作製を試みた。すなわち、ヒトMDR1 geneをmammalian cellで強発現するGFPベクターの3'側に挿入したconstructを作製した。かかるプラズミドをtransfectionしたHeLa細胞からcell lysateを回収し、anti-GFP抗体、C219(anti-P-glycoprotein抗体)を用いたWestern blottingに供した。分子量から目的のGFP-MDR1融合蛋白が合成されていることが確認された。
GFP-MDR1融合蛋白の細胞内挙動は上記プラズミドをtransfectionしたHeLa、肝癌由来HepG2,HuH7、腎上皮細胞由来MDCK、腸上皮細胞由来Caco2細胞について共焦点レーザー顕微鏡にて観察した。GFP-MDR1融合蛋白はcytosolのvesicle内に局在したが、membraneにはtargetingする像は得られなかった。
平成11年度はGFPベクターの5'側にMDR1 geneを挿入したconstructを作製し(MDR1-GFP)、GEP-MDR1融合蛋白との局在の相違などからP-glycoproteinの細胞内移送に関与するregion、ならびに移送機構の解析を行う予定である。