| 研究課題/領域番号 |
10670508
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
消化器内科学
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| 研究機関 | 東海大学 |
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研究代表者 |
加川 建弘 東海大学, 医学部, 講師 (30245469)
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| 研究分担者 |
細井 克美 東海大学, 医学部, 助手 (50317814)
西崎 泰弘 東海大学, 医学部, 講師 (80237693)
渡辺 勲史 東海大学, 医学部, 助教授 (90167156)
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| 研究期間 (年度) |
1998 – 1999
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| キーワード | p-glycoprotein / hepatocyte / multidrug resistance / green fluorescent protein / intracellular trafficking |
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| 研究概要 |
肝細胞のcanalicular membraneに局在するP-glycoprotein(multidrug resistance1, MDR1)の細胞内移送機構を解析するため、P-glycoproteinとgreen fluorescent protein(GFP)を融合蛋白として発現するベクターの作製を試みた。ヒトMDR1 geneをmammalian cellで強発現するGFPベクターの3'側(pGFP-hMDR1)ならびに5'側(phMDR1-GFP)に挿入したconstructを作製した。かかるプラスミドをtransfectionしたHeLa細胞からcell lysateを回収し、anti-GFP抗体、C219(anti-P-glycoprotein抗体)を用いたWestern blottingに供した。220KDの分子量が目的のGFP-MDR1融合蛋白が合成されていることが確認された。
GFP-hMDR1融合蛋白はcontrolであるGFP単独の場合と同様、細胞内にdiffuseに発現していた。一方、hMDR1-GFP融合蛋白はplasma membraneに局在していた。photobleacing後、一時間経過により蛍光が復帰することから細胞内で融合蛋白が合成され、plasma membraneにtargetingされていることが確認された。しかしながら、HepG2細胞ではplasma membraneに局在が見られたものの遺伝子導入効率が極めて悪く(0.01%以下)、蛍光強度も微弱であったため、詳細な観察は困難であった。GFP-hMDR1とhMDR1-GFPの局在の相違はGolgiから目的の領域にsortingされる機序を考察する上で非常に興味深く、我々の作製したconstructがさらなる研究に有用と考えられた。
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