| 研究概要 |
1. ヒト気管支培養上皮細胞のパッチクランプ:単離したヒト上皮細胞にパッチクランプ法(whole cell clamp,inside-out patch)を適用し,Clチャネルの開確率を測定した.その結果,NO産生刺激薬である高Ca^<2+>溶液とブラディキニン,あるいはNOドナーであるs-nitroacetyl-peniillaine(SNAP)やニトロプルシドを細胞内液に添加すると,単一Clイオンチャネル電流の発生がみられ,Clチャネル開確率は増加した.また,その効果はL-NAME,アミノグアニジン,クロルプロマジンの存在下で抑制されたことより,iNOSの関与が示唆された.
2. 気道上皮由来のNOの測定:NO選択電極と比較電極を培養気道上皮細胞の灌流液に浸漬し,上記薬剤の投与によって発生する拡散電流をNOメーターにてモニターし,ポーラログラフィーの手法を適用しNO産生を直接測定した.ブラディキニン,ニトロプルシドは,いずれも用量依存的にNO産生を増加させ,以上の反応はL-NAMEおよびアミノグアニジンによりほぼ完全に消失した.
3. NOSサブタイプの決定:あらかじめ気管支摘出組織標本に対しNADPH diaphorase活性の組織化学を施行し,気道上皮細胞におけるNOSの局在が確認された.次いで,コンフルエントとなった培養上皮細胞を用い,cNOS,iNOS各々のモノクローナル抗体にて免疫蛍光抗体法を行った結果,ブラディキニンとニトロプルシドはiNOS蛋白の発現を誘導することが明らかとなった.
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