| 研究概要 |
【目的】昨年度、トロンビン刺激後の培養血管内皮細胞に血小板が粘着・凝集することをVEC顕微鏡で動的観察し、その定量化を試みた。本年度は、これらの粘着・凝集現象に対する血小板膜糖蛋白(GP)IIb/IIIa,GPIbαの関与を検討した。
【方法】ヒト大動脈血管内皮細胞(human aortic endothelial cell:HAEC)を観察用カバーグラス上に,confluentな状態に培養した。観察には倒立型Nomarski顕微鏡、微分干渉対物レンズ、CCDカメラ、画像処理装置からなるVEC-DIC顕微鏡を用い、拡大率3000-8000倍で観察した。また健常人より採血した多血小板血漿(PRP)を作成した。実験(1):多血小板血漿(PRP)ををHAEC上を30分間灌流(shear rate 10/sec)し、洗浄後、HAECに粘着した血小板数を定量評価した(A群:N=6)。実験(2)トロンビン(human α-thrombin)1.0U/mlをHAEC上に30分間潅流し、緩衝液にて洗浄、その後、PRPを20分間潅流、再度洗浄後に、血小板の内皮への粘着凝集の状態を観察した(B群:N=8)。実験(3)トロンビン刺激後、PRP+TAK029(GPIIb/IIIa拮抗薬;1μM)を潅流。洗浄後、同様の観察を行った。(C群:N=6)。実験(4)トロンビン刺激後、PRP+GUR20-5(抗GPIbα抗体;20μg/ml)を潅流。洗浄後、同様の観察を行った(D群:N=5)。血小板の内皮への粘着・凝集の定量化;程度は30μmX30μmの区間へ粘着・凝集した血小板の数を各々100区画数え、その平均で評価した。【成績】平均粘着血小板数は、A群;0.3±0.7/900μm^2,B群では16.1±9.8/900μm^2(p<0.01,vs A群)、C群;0.4±0.3/900μm^2(p<0.01,vs B群)、D群では14.2±9.0/900μm^2であった。【結論】上記結果は、血管内皮細胞がトロンビン刺激を受けた場合に低流速下では血小板が内皮細胞に直接粘着・凝集し、その粘着・凝集にGPIIb/IIIaが関与していることを示している。
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