| 研究概要 |
[目的]HSVE患者11例,24髄液検体を用い化学発光法により髄液内HSV抗原量,single PCR法(最小検出感度;50Pfu/ml)およびnested PCR法(最小検出感度:20-50 copy/ml)により髄液内HSV-DNA量を定量する。
[方法]化学発光法による髄液内HSV抗原量の測定系:髄液,ルミノール含有medium,血漿,および正常顆粒球浮遊液を37℃でincubateし,抗HSV抗体を加えたassay系を用い、髄液検体の化学発光量をluminescence readerで測定する。この値を、既知ウイルス量から作成した基準曲線により、髄液中のHSV抗原量を測定する。single PCR法による髄液内HSV-DNA定量の測定系:髄液を65℃にて1時間protenase Kを含むlysis bufferで処理し,DNAをphenol-chloroform処理で抽出した。用いたOligonucleotide primersとprobeは、HSV-DNA polymerasegeneより選択した。PCRはdenaturation94℃1分,primer annealing 58℃2分,primer extension72℃2分,40 cyclesでおこなった。増幅DNAは電気泳動で234 bp sequenceで検出した。PCR産物の信号強度をdensitometerで測定し、既知ウイルス量から作成したregression curveから髄液中のHSV-DNA sequence量を定量する。nested PCR法による髄液内HSV-DNA定量の測定系:Kimuraらの方法(KimuraH,et al:J Infect Dis l991 and Ando Y,et al:JMed Virol 1993)に従った。用いたOligonucleotide primersは、polymerase geneより選択した。PCRはdenaturation 96℃l分,primer annealing 67℃2分,primer extension 72℃3分で35cyclesおこなった。増幅DNAはagarose gelに330 bp sequenceで検出した。Southern blotsにおけるPCR産物のradioactivityをimage analyzing systemで測定し髄液中のHSV-DNA sequence量を定量する。
[結果]化学発光法では,l検体(20病日)を除く第3〜25病日の全髄液検体にて50〜48.000 pfu/ml相当の抗原量を検出し得た。single PCRでは6検体において50〜47.000 pfu/mlのゲノム量を検出し得た。nested PCRでは11検体において100未満〜120.000copy/mlのゲノム量を検出し得た。以上の結果から、HSVEにおける全体としての各測定法の感度は症例ベースで化学発光法100%,single PCR36%,nested PCR56%であり、検体ベースで化学発光法88%,single PCR25%,nested PCR52%であった。
[平成11年度の研究計画]非HSVEの患者検体を用い上記3測定法にて検討する。これらの結果から感度の他に、各測定法の特異性,positive predictive value,negative predictive valueについて求め、統計学的に比較検討する。
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