消化器癌における多剤耐性遺伝子発現の定量的検討

1998 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 10671229
• 研究機関: 川崎医科大学
• 研究代表者: 川島 邦裕 川崎医科大学, 医学部, 講師 (20299233)
• 研究分担者: 清水 憲二 岡山大学, 医学部, 教授 (10037286)
• キーワード: 薬剤耐性 / 消化器癌 / mdr / mrp / Competitive PCR

研究概要

今年度は実験系を確立した。MDR、MRPの高発現株であるKB-C2よりRNAを抽出し、mdr-1、mrpの特定領域を増幅させるプライマーを使用してRT-PCR法を行い、増幅後、クローニングした。クローニングしたPCR productを制限酵素処理をしてinternal deletionを作ることによりcompetitorを作成した。mdrのPCRproductのサイズは609bpで、制限酵素NCoI+StuI処理をすることにより、120bp deletionの489bpのcompetitorを作成した。同様にmrpのPCR productは693bpで、BstP1+Stu 1処理をすることにより155bp deletionの538bpのcompetitorを作成した。このcompetitorはそれぞれ、先に使用したmdr、mrpと同じプライマーにて増幅することができ、しかもオリジナルの増幅産物とはproductの長さが異なるため、アガロース電気泳動での判別が可能であった。
competitorもクローニングし、濃度を測定し保存した。competitorを既知の濃度(1amol、2amol、5amol、10amol、100amol、1fmol、10fmol、50fmol、100fmol)で添加したPCR tubeに、KBC2より抽出したtotal RNA5μgより作成したcDNAを加えてcompetitive RT-PCRをすることで、KBC2のmdr、mrpを定量的に測定することができた。KBC2を使用した予備実験を行い、PCR条件、PCR回数を決定した。以上により腫瘍のmdr、mrpを定量的に測定するcompetitive PCR法が確立された。
現在、川崎医科大学にて手術を施行され、腫瘍が凍結保存されている各種消化器癌症例を対象に、今年度購入した多検体を一度に処理できるオイルフリーPCR装置を使用し、上記により確立された方法でcompetitive PCRを施行し、薬剤耐性遺伝子発現の定量を行っている。

研究成果

• [文献書誌] Tsunoda Tsukasa,et al.: "Staging and treatment for patients with pancreatic cancer.How small is an early pancreatic cancer?" J.Hep.Bil.Pancr.Surg.5・2. 128-132 (1998)
• [文献書誌] 久保添忠彦 他: "大腸癌早期(術後1年未満)死亡症例の検討" 日本外科系連合学会雑誌. 23・4. 670-673 (1998)
• [文献書誌] 角田 司 他: "肝内結石症に合併する胆管癌;最新の知見" 消化器外科. 21・9. 1493-1499 (1998)
• [文献書誌] Ikeda Masahiko,et al.: "Close correlation between mutations of E2F4 and hMSH3 genes in colorectal cancers with microsatellite instability" Cancer Research. 58. 594-598 (1998)
• [文献書誌] Takimoto Hidetaka,et al.: "Genetic alterations in the retinoblastoma protein-related p107 gene in human hematologic malignancies" Biochem.Biophys.Res.Commun.251. 264-268 (1998)
• [文献書誌] 清水 憲二 他: "「がん遺伝子・がん抑制遺伝子」" 中外医学社(東京) 渋谷正史、山本 雅 編, 317 (1998)
• [文献書誌] 清水 憲二 他: "「癌化のメカニズムを解く」" 羊土社(東京) 横田 淳 編, 125 (1998)