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骨膜凍結条件を決定した。凍結保護剤にはヒト胚の培養に用いられるIVF AH25培養液に0.2Mトレハロース、抗生物質(ホスミシン、10μg/ml)、12%ジメチルスルフォキシド(DMSO)および50%(V/V)鶏卵黄を添加したものを用いた。受精18日鶏胚の大腿骨より採取した5mm^2大の骨膜を直接凍結保護材1.0ml含む凍結バックに入れ、シールした後エタノールを冷媒としたプログラムフリーザーを用い、室温/+-7℃(2.0℃/分)、-2.0℃/40℃(1.0℃/分)で凍結し、その後直ちに液体窒素に浸漬して-196℃とし、凍結保存した。融解は微温湯中で行い、培養液で洗浄した。融解骨膜を受精9日鶏卵より作製した漿尿膜培地に移植して10日間培養し、ソフテックスを用いてX線撮影を行い、骨形成の有無を確認した。
凍結保護剤の添加、除去方法の検討した結果、凍結保護剤に骨膜を直接添加し、融解後は培養液で直接洗浄することにした。3.DMSO不含凍結保護剤を用いた場合は新生骨形成を認めず、凍結保存に際してDMSOが必須であることを認めた。DMSO濃度は6-18%の範囲で同程度の骨新生を認め、本研究では12%を採用した。一方、卵黄不含凍結保護剤では新生骨形成は著しく低く、骨膜の凍結に際してはDMSOとともに卵黄が重要な意義を有することを見いだした。卵黄濃度は10-88%の範囲で保護効果を認めた。さらに精製卵黄レシチンを卵黄の代わりに添加しても、卵黄の場合と同様な保護効果を認めた。長期保存(1週間、1ヶ月、3ヶ月)を行った結果、いずれも同程度の骨新生率を認め、長期保存が可能であることが示唆された。
透過型電子顕微鏡を用いて細胞像を観察した結果、組織表層の細胞は小器官の膨化等の変性像を認めたが、深層部では細胞膜、小器官の形態が保持されていた。上述した細胞酸化還元能の結果とともに、組織の一部が機能を保持したまま凍結保存できたと考えられる。
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