| 研究概要 |
【目的】癌遺伝子Bcl-2はアポトーシス抑制遺伝子であり,抗酸化剤として酸素ストレスによって生じるアポトーシスを抑制する.我々は肝虚血時に起こる肝実質細胞に由来する活性酸素による選択的類洞内皮細胞のアポトーシスに,Bcl-2の細胞内分布の変化が関与しているとの仮説をたてており,この仮説を証明し,類洞内皮細胞のアポトーシスの抑止策を検討することを目的とした.
【方法】
(1) 虚血肝における肝構成細胞内のBcl-2分布の変化に関する研究
(1)ラット肝虚血モデルでDCFH-DAを負荷し,生体蛍光顕微鏡にてH2O2産生量を測定する.(2)肝組織パラフィン切片を用い,Apop Tag in situ detection kitにてアポトーシス細胞を同定する.(3)肝組織をコラゲナーゼで灌流しエルトリエーターで肝細胞と類洞内皮細胞に分離し,Bcl-2蛋白量をwestern blotで,m-RNAをnorthen blotで解析する.(4)肝組織の凍結超薄切片を作成し,免疫電顕法でBcl-2蛋白の細胞内での動きを観察する.(5)特異的キサンチンオキシダーゼ阻害剤であるBOF4272を前投与したラットを用い同様の実験を行う.
(2) BOF4272前処置肝,Bcl-2 transfection 肝による虚血再灌流実験
BOF4272前処置マウス,Bcl-2 transfectionマウスを用いて肝虚血再灌流実験を行い,肝障害,肝細胞,類洞内皮細胞のアポトーシスの有無,Bcl-2蛋白,m-RNAについて検討する.
【結果,今後の予定】研究(1)により肝虚血時のアポトーシスが生じている類洞内皮細胞においてBcl-2蛋白量の低下をまた細胞内でのBcl-2蛋白の偏在を免疫電顕法にて確認した.今後は研究(2)によりBcl-2 transfectionなどによるBcl-2の制御が類洞内皮細胞のアポトーシスを抑止うるかを検討する.
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