| 研究概要 |
ニューロペプチドYについてデータベースより遺伝子をピックアップし以下の方法によって、ddN系、C57BL系について比較検討を行っているが、現在のところあきらかな系統差はみとめられていない。ニューロペプチドY以外の、グルタメートレセプターについてのプライマー作成に着手している。
(1) プライマーをデザインし、作成を業者に委託する。
(2) ddN系、C57BL系マウスの尻尾より、DNAを単離する。1cmほど尻尾を切断し、これをProteinaseK500μg/ml含有50mMTris-HCL,100mMNaCI,100mMEDTA,1%SDS溶掖に入れ、42度で一晩放置し、溶解する。飽和食塩水を1/3量加え、遠沈し、エタノール沈殿させて析出したDNAを1mMEDTA含有40mMTris-acetate溶液に浮遊させる。
(3) 得られたDNAを基質とし、(1)で作成したプライマーを用いて非対称PCRを行って1本鎖DNAを得る。
(4) Dideoxy chain terminator法により、塩基配列を決定する。
(5) ddN系、C57BL系マウスを断頭し、脳を摘出。ドライアイスーアセトンで、凍結後、100ミクロン厚のFresh frozen sectionを作成。顕微鏡下に視交叉上核、室傍核、海馬をパンチアウトする。
(6) 得られた組織片からtotal RNAを抽出。個体数を調節してRNA量が10〜20μgになるようにする。
(7) 逆転写反応によってcDNAを作成。BAPを添加後、アガロースゲルにアプライし、電気泳動。UVランプ上で、バンドを観察。系統間で相違するバンドをきりだし、ウルトラフリーによってDNAを回収する。
(8) このDNAに対してPCRを行い、これを鋳型として塩基配列を決定し、系統間で比較する。(このPCRに際しては、DNAをpBluescriptにクローニングする必要がある。)
もととなったmRNAが片方の系統にのみ発現していたのなら、塩基配列決定後、改めてプライマーを作成し、(1)〜(4)に準じて2系統について分析、塩基配列決定する。
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