| 研究課題/領域番号 |
10671492
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| 研究機関 | 慶応義塾大学 |
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研究代表者 |
鈴木 ゆり子 慶應義塾大学, 医学部, 助手 (40255435)
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| 研究分担者 |
村井 勝 慶應義塾大学, 医学部, 教授 (90101956)
池田 英之 慶應義塾大学, 医学部, 講師 (40301494)
河上 裕 慶應義塾大学, 医学部, 教授 (50161287)
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| キーワード | SEREX / 腎癌抗原 |
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| 研究概要 |
腎癌組織由来の5細胞株を入手し、各々培養して約10^8細胞から全RNAを抽出した。電気泳動により精度の高い4細胞株の全RNA約0.5mgを混合し、オリゴ(dT)によってポリA^+RNAの選別を2回行い約20μgのポリA^+RNAを得た。ZAP express cDNA synthesis kit(Stratagene社)を用い、5μgのポリA^+RNAからバクテリオファージcDNAライブラリーを作成した。1×10^6のプライマリーサイズのファージライブラリーを1回増幅し、4.7×10^<10>pfu/mlのタイターで使用した。4検体の患者血清を用いて、作成した腎癌細胞株cDNAライブラリーのスクリーニングを行った。1検体の血清につき、50枚の直径15cmのシャーレに各々約1万のプラークを生じるようプレートした。誘導試薬IPTGで組換体タンパクを大腸菌に発現させ、ニトロセルロース膜に転写した。プロットしたニトロセルロース膜に1000倍希釈患者自己血清を加え、さらに アルカリフォスファターゼ標識抗ヒトIgG抗体を加えて発色させた。4検体の患者血清の免疫応答能に違いがあるためか、発色の見られたプラーク数は著しく異なった。4検体の内2検体では発色がはっきりせず陽性クローンを得ることができなかった。1検体は20の陽性クローンを得ることができた。他の1検体では192もの陽性クローンを得ることができた。今後さらに2次スクリーニングを行って擬陽性を除き、DNA塩基配列決定、RT-PCRなどを行う予定である。
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