| 研究課題/領域番号 |
10671503
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| 研究機関 | 関西医科大学 |
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研究代表者 |
松田 公志 関西医科大学, 医学部, 教授 (20192338)
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| 研究分担者 |
六車 光英 関西医科大学, 医学部, 助手 (10239460)
川喜田 睦司 関西医科大学, 医学部, 助教授 (50252458)
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| キーワード | 低温誘導性蛋白 / 減数分裂 / 精子形成 / レトロウィルス / 男性不妊 / 精索静脈瘤 |
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| 研究概要 |
本研究では低温誘導性RNA結合性蛋白の遺伝子をレトロウィルスを用いて導入、発現量をマウス精子形成細胞株において変化させ増殖・分化能への影響を調べる事を一つの目的としている。そのためまずこれらの細胞株に対し最適なレトロウィルスの作成を行った。
レトロウィルスによるマウス生殖細胞株(GC1およびGC2)に対して遺伝子導入に際して、最適なプロモーターを決定するために様々なレトロウィルスLTRにレポーター遺伝子(CAT)をつないで導入して高発現のレトロウィルスLTRを決定した。また各レトロウィルスLTRにMDR遺伝子をつないだレトロウィルスベクターを作成、これをヘルパー細胞に導入しレトロウィルスを発現させ実際にGC1,GC2に感染させた。そして通常では細胞が死滅する濃度のコルヒチンを投与し、MDR遺伝子が実際に発現しているかどうかをコロニー形成アッセイにて検討した。するとCATをレポーターとして用いた一過性発現による結果とほぼ相関する結果が得られた。さらに上記のウィルスを感染させたのちにコルヒチンにて選別した細胞をローダミンを加えた培養液にインキユベートした後、ローダミンの細胞内からの排出能を比較したところ、やはり前述の実験と相関する結果が得られた。以上の検討から最も適していると考えられたレトロウィルスLTRを選択し、レトロウィルスの基本骨格にレポーターとして表面抗原を同時に発現するようにしたウィルスを作製し、これをGC1およびGC2へ感染させた後にフローサイトメトリーにて表面抗原の発現を測定し、これらの細胞にレトロウィルスによりレポーター遺伝子が導入され、発現することを確認した。
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