| 研究概要 |
研究経過
乳児内斜視および間歇性外斜視の症例に対して,治療として行った斜視手術の際に得た外眼筋組織を凍結破砕し,両筋からmRNAを抽出した(Invitrogen,Fast Track2.0)。mRNAからcDNAを合成し,乳児内斜視筋のcDNAに2種類のアダプターをつけ間歇性外斜視筋のcDNAとハイブリダイズさせた後,アダプターに相補的なプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を2回行い,乳児内斜視筋にのみ存在するcDNAを増幅した(CLONTECH,PCR-Select)。PCR産物をゲル上で電気泳動した結果100〜500塩基対に広がるスメアが得られ,中でも150塩基対のところに明らかなバンドが認められた。
PCR産物をプラスミド(pCRII-TOPO)に挿入し,形質転換を行った。(Invitrogen,TOPO TA Cloning)その後Plasmiid Mini preparation(Qiagen)を用いてプラスミドDNAを抽出し計240個のクローンを単離した。
PCR産物(cDNA)を解析するために両筋から抽出したmRNAをナイロンメンブレン(Amersham,Hybond-N+)にドットブロット用96穴吸引濾過装置(BIORAD)を用いてスポットして,アルカリフォスファターゼをラベリングしたcDNAをプローブとしてハイブリダイズさせ,高感度基質CDP-starにより内斜視に特異的に発現しているクローンを検出した(Amersham,Gene images)。スクリーニングの結果より単離した10個のクローンは蛍光自動シークエンサー(Perkin Elmer,ABI PRISM 310)を用いて塩基配列を決定した。シークエンス結果についてはデータベース(BLAST)でホモロジー検索を行った。
|
