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我々は、本研究においてグリオキサールが弱酸性水溶液中で加熱するとN末端Trp含有ペプチドと高選択的に反応して蛍光体のみならず化学発行体も形成することを見いだした。それは酸化的に発光するので、この誘導体化反応及び酸化反応である化学発光反応の最適条件を検討した。その結果、化学発光誘導体化反応はpH4の弱酸性溶液中80℃で5分間の加熱により速やかに進行し、この反応液をH_2O_2存在下ホウ酸ナトリウムによりpH9付近の弱アルカリ性にすると化学発光反応が起こり、生じる発光を鋭敏に検出できた。このマニュアル操作に基づき、定量下限が0.5nMレベルのN末端Trp含有ペプチドの定量法と3μMレベルの定量下限を示すH_2O_2の定量法をそれぞれ開発できた。
そこで、この反応によって生成する両発光物質を高速液体クロマトグラフィー(HPLC)によって分離し、LC/MSによって分子量を測定した。その結果、生成した蛍光物質と化学発光物質はともに2分子のグリオキサールがN末端Trp残基に付加したものと考えられ、化学発光体はグリオキサールが付加したのち2分子の水が脱水した構造であり、それからさらに1分子脱水したものが蛍光体であることを推定した。
次に、グリオキサール反応をHPLCのポストカラム誘導体化反応に適応させてN末端Trp含有ペプチド群の高感度な化学発光検出システムを構築した。この化学発光検出システムは、UV吸収や蛍光検出法よりも5-60倍高い感度を有し、約100fmol〜3pmol/注入量のN末端Trp含有ペプチド類を検出(S/N=3)できた。開発したHPLCシステムにより、熟成中の醤油成分からN末端Trp含有ペプチドと考えられる微量の未知成分を検出することができた。今後、これらの成分の化学構造を解明し、生体に及ぼす機能解析研究や生体細胞内の極微量の未知ペプチドの探索研究へ展開する予定である。
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