| 研究課題/領域番号 |
10672061
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| 研究機関 | 東京理科大学 |
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研究代表者 |
田代 文夫 東京理科大学, 基礎工学部, 教授 (70089332)
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| 研究分担者 |
杉山 晶規 東京理科大学, 基礎工学部, 助手 (40260319)
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| キーワード | 神経分化誘導因子 / 小脳cDNA発現ライブラリー / ラットgrp75 / ヒートショックタンパク質 / PC12細胞 / 順化倍地 / GST融合タンパク質 / pCD-2発現ベクター |
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| 研究概要 |
我々は今までに小脳mRNAを材料としてpCD-2発現ベクターを用いてcDNAライブラリーを作製し、COS-1細胞に導入して一過性に発現させ、その順化培地をPC12細胞に添加すると交感神経様細胞に分化誘導するするクローン398が得ている。本クローンは約1.1kbのインサート配列を有し、ヒートショクタンパク質ファミリーに属するラットgrp75のC末端領域に高い相同性を示す67アミノ酸残基から成るORFが存在する。本研究においては、まずクローン398にコードされる67アミノ酸残基から成る新規神経栄養因子の大量生産システムの確立と特異的抗体の作製を試みた。
クローン398にインサート配列をPCR法により増幅し、pTZ19RのSma Iサイトにサブクローニングした。このクローンをSau 3AIで処理し、Bam HIとEco RIで処理したpGEX-2Tに導入してCSTとの融合タンパク質を発現するプラスミドを作製した。本プラスミドを導入したJM109株を100μM IPTG存在下で培養し、融合タンパク質を得ることができた。融合タンパク質は、菌体を超音波で可溶化後、グルタチオン-セファロースカラムにかけ還元型グルタチオで溶出した。その結果、500ml培養から1.2mgの融合タンパク質が得られた。次に、融合タンパク質50μgをBALB/cA Jclマウスの皮下に投与して、抗体の作製を試みた。その結果、ウエスタンブロット法で融合タンパク質を認議する抗体を得ることができた。しかし、モノクローナル抗体の作製はできなかった。来年度は、融合タンパク質とそれに対す抗体を用いてPC12細胞に直接作用させることによって交感神経様細胞に分化させることができるのかどうか、またクローン398がαCOS-1細胞での神経栄養因子の発現を誘導して間接的に作用しているかどうかを明らかにする予定である。
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