| 研究概要 |
石油や有機塩素化合物により汚染された土壌、海域、地下水等のバイオレメディエーションを効率化するためには、芳香族化合物分解菌群のモニタリング法が必要となる。本研究では、種々の芳香族化合物の生分解がカテコールを経由する事に着目し、カテコール1,2ジオキシグナーゼ(以下C120)及びテコール2,3ジオキシグナーゼ(以下C230)をコードする遺伝子をそれそれ検出するプライマーの設計を行った。さらに、環境試料からの検出を行うための遺伝子抽出法を検討した。GenBankに登録されているC120遺伝子11種、C230遺伝子20種の遺伝子配列データを入手し、各配列中で比較的相同性の高い配列を、相補率が低くならないように、フォワード、リバースの各プライマー候補に複数選択し、その有効性をPCRシミュレーションソフトAmplify(Ver.1.2,Universityof Wisconsin,1992)によるシュミレーションと実験的検討により評価した。その結果、GenBankに登録されているC120遺伝子の全てとC230遺伝子の17種を検出出来るプライマーセットを作成できた。さらに環境中より分離した芳香族化合物分解菌に対して各プライマーセットを適用したところ、芳香族化合物分解活性を持つ環境微生物の50-80%を検出することができ、本プライマーの高い実用性が示された。続いて、水および土壌試料からのDNA抽出法について、抽出試薬、物理的細胞破砕操作、精製法などの影響を検討し、多様な水試料、土壌試料にそれぞれ適用可能なDNA抽出法を確立した。さらにMPN-PCR法を利用した目的遺伝子の定量に成功した。以上の結果より、多様な環境試料に存在する芳香族化合物分解菌群を検出・定量することが可能となり、今後、石油系炭化水素分解菌群のモニタリングへの応用が期待できる。
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