ラジカル酵素の立体構造と触媒機構の研究

1999 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 10680611
• 研究機関: 岡山大学
• 研究代表者: 虎谷 哲夫 岡山大学, 工学部, 教授 (70026318)
• 研究分担者: 山西 守 岡山大学, 工学部, 助手 (30240063) ; 飛松 孝正 岡山大学, 工学部, 助教授 (30188768)
• キーワード: B_<12>補酵素 / ジオールデヒドラターゼ / 結晶構造解析 / 密度汎関数法 / 再活性化因子 / 分子シャペロン / グリセロールデヒドラターゼ

研究概要

(1)ジオールデヒドラターゼとシアノコバラミンの複合体の結晶構造を解析した。コバラミンは下方配位子の塩基5,6-ジメチルベンズイミダゾールがコバルトに配位したままで酵素に結合しており、これはB12結合蛋白質で初めての例である。活性部位はTIMバレルの内部にあり、これはラジカル中間体を副反応から守るための構造と考えられる。活性部位にK^+が存在し、基質の2つの水酸基がこれに配位していることから、K^+が酵素反応に直接関与する可能性が示唆された。
(2)密度汎関数法による理論計算の結果、ジオールデヒドラターゼの反応は環状遷移状態を経由する協奏機構で進行することが示唆された。活性部位のK^+は遷移状態のエネルギーを下げるとともに、基質結合エネルギーを大きくする役割を担うことにより間接的にコバルト-炭素結合の活性化に寄与すると推定された。
(3)コバラミン補酵素関与酵素はラジカル機構で触媒するが故に不活性化され易い。先に発見したジオールデヒドラターゼ再活性化因子の作用機作を解明し、この因子がADP存在下で高親和性型となり、酵素の立体構造変化を引き起こすことにより固く結合している修飾された補酵素を解離させること、そしてATPが酵素-再活性化因子複合体を解離させて活性なATP酵素を生成させることを示した。従って、この因子は1種の分子シャペロンであることが明らかとなった。
(4)グリセロールデヒドラターゼに対する再活性化因子も存在することをこれまでに明らかにしてきたが、今回はその遺伝子を初めて同定し、高発現させた。再活性化因子は酵素遺伝子の直下流および上流側の2つの遺伝子によってコードされており、両サブユニットともジオールデヒドラターゼ再活性化因子と高い相同性を示した。

研究成果

• [文献書誌] T.Toraya: "Radical Catalysis of B12 Enzymes: Structure, Mechanism, Inactivation and Reactivation of Diol and Glycerol Dehydratases"Cell. Mol. Life Sci. (in press). (1999)
• [文献書誌] K.Yamada, et al.: "Heterologous High level Expression, Purification, and Enzymological Properties of Recombinant Rat Cobalamin-dependent Methionine Synthase"Journal of Biological Chemistry. 274. 35571-35576 (1999)
• [文献書誌] K.Mori, and T.Toraya,: "The Mechanism of Reactivation of Coenzyme B12-Dependent Diol Dehydratase by a Molecular Chaperone-Like Reactivating Factor"Biochemistry. 38. 13170-13178 (1999)
• [文献書誌] T.Toraya, et al.: "Direct Participation of Potassium Ion in the Catalysis of Coenzyme B12-Dependent Diol Dehydratase"Journal of Biological Chemistry. 126. 650-654 (1999)
• [文献書誌] J.Masuda, et al.: "Crystallization and Preliminary X-ray Study of Two Crystal Forms of Klebsiella oxytoca Diol Dehydratase-cyanocobalamin Complex"Acta. Crystallogr.. D55. 907-909 (1999)
• [文献書誌] N.Shibata, et al.: "A New Mode of B12 Binding and the Direct Participation of a Potassium Ion in Enzyme Catalysis. X-ray Structure of Diol Dehydratase"Structure. 7. 997-1008 (1999)
• [文献書誌] T.Tobimatsu, et al.: "Identification and Expression of the Genes Encoding a Reactivating Factor for Adenosylcobalamin-dependent Glycerol Dehydratase"J. Bacter. 181. 4110-4113 (1999)