ナノ秒時間分割蛍光エネルギー移動測定による筋タンパクの動的性質研究

1999 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 10680629
• 研究機関: 福井大学
• 研究代表者: 三木 正雄 福井大学, 工学部, 教授 (30242580)
• キーワード: ナノ秒時間分割 / 蛍光エネルギー移動 / 筋肉タンパク / 筋収縮制御 / トロポニン / トロポミオシン

研究概要

本プロジェクトは名古屋大学理学部の御橋研究室から当研究室に移管された20年以上前のナノ秒時間分割蛍光光度計を修理して蛍光寿命測定を可能にし、筋肉タンパク質のアクチン、ミオシン、トロポニン、あるいはトロポミオシンの特定のアミノ酸殘基に蛍光色素をラベルし、これら色素間の蛍光エネルギー移動を定常励起光蛍光測定とナノ秒時間分割蛍光寿命測定の2つの方法により行うことにより、これらタンパク内あるいはタンパク間の2つの色素の間の距離や距離分布を様々な生理活性状態に応じて求めることにより、筋タンパクの生理活性と動的な構造変化との関連について調べることである。
この為にTiming to Amplitude Converter(Ortec 457),ヘッドオン型光電子増倍管やMulticahnnnel Analyzerは修理不能の為これらを新しく購入し、装置のセットアップをほぼ完了したもののまだこの装置を使っての成果はでていない。一方、蛍光測定の為のサンプルとして、変異トロポミオシン及びトロポニンサブユニットを大腸菌を使って大量発現し精製して、これら変異トロポミオシンやトロポニンサブユニットを使って、カルシウムイオン濃度変化によるトロポミオシン-トロポニンによる調節のメカニズムについての構造にもとづいた情報を得る為の蛍光エネルギー移動測定を行い、これらデータから筋収縮のトロポニン-トロポミオシンによる阻害においては、TnIとアクチンのouter-domainとの安定な複合体形成が重要であることが分かった。本プロジェクトにおいては、いくつかの研究成果は得られたが、当初計画していた研究目的については、未だ60%程度しか達成されていない。今後は、蛍光寿命測定装置を使っての蛍光エネルギー移動測定や、その解析プログラムを充実させ、研究成果を発表していく所存である

研究成果

• [文献書誌] Miki,M.et al.: "Ca^<2+>-induced distance change between points on actin and troponin in skeletal muscle thin filaments estimated by fluorescence energy transfer spectroscopy."J.Biohem. 123. 324-331 (1998)
• [文献書誌] Miki,M.et al.: "Fluorescence resonance energy transfer between points on tropomyosin and actin in skeletal muscle thin filaments: Does tropomyosin move?."J.Biohem. 123. 1104-1111 (1998)
• [文献書誌] Hai,H.et al.: "Conformational Changes of the troponin-tropomyosin complex on F-actin observed by fluorescence resonance energy transfer measurements."J.Fluorescence. (in press). (2000)
• [文献書誌] Miki,M.: "Structural changes between regulatory proteins and actin: A regulation model by tropomyosin-troponin based on FRET measurements in Molecular Interactions of Actin (dos Remedios, C.G. and Thomas, D.D., eds)"Springer Verlag,Heidelberg (in press). (2000)