| 研究課題/領域番号 |
10680632
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
杉山 康雄 名古屋大学, 大学院・理学研究科, 助教授 (70154507)
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| 研究分担者 |
井原 邦夫 名古屋大学, 大学院・理学研究科, 助手 (90223297)
楠見 明弘 名古屋大学, 大学院・理学研究科, 教授 (50169992)
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| キーワード | レチナールタンパク質 / 光駆動イオンポンプ / 光センサー / 異種細胞発現系 / 分裂酵母 / GFP融合タンパク質 / (His)6-Tagタンパク質 |
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| 研究概要 |
目的
高度好塩菌の細胞膜にあるレチナールタンパク質の立体構造解析を目指して、ハロロドプシン(hR)やセンソリーロドプシン(sR)類、そして、我々が3属7種の好塩菌から遺伝子を単離してアミノ酸配列を決定したイオンポンプ11種類とセンサー4種類の大量発現系を構築し、それらの大量精製法を確立する。
結果
1. レチナールタンパク質遺伝子の分裂酵母S.pombeでの発現と発現部位の同定
既に構築してあった大腸菌用ベクターpUC-bop、pUC-aop、及び、pUC-hopを鋳型として、bop.aop、及び、hop遺伝子をPCRで増幅した。今回作成したクローンは、N末端にpresequenceをもつもの、成熟タンパク質、C末に(His)6-Tagをもつもの、C末にAequorea victoriaの緑色蛍光タンパク質(GFP)を融合したものである。PCR産物を分裂酵母発現ベクターpREP-1へ導入した。これらのベクターで形質転換した酵母細胞をレチナール存在下に培養した。N末端のpresequenceとC末端の(His)6-Tagはレチナールタンパク質の発現量に影響を与えなかった。C末端にGFPを融合したタンパク質の発現量は少し低下したが、蛍光顕微鏡で発現タンパク質の所在を追跡したところレチナールタンパク質は細胞内膜系に分布していた。
2. S.pombeで発現させたレチナールタンパク質の単離精製
分裂酵母(C末端に(His)6-Tagをつけたレチナールタンパク質を発現した)をガラスビーズで破砕し、膜断片とした。ドデシルマルトシド、あるいは、スクロースモノラウレートで可溶化した膜をNi-NTAアガロースとインキュベートしたところ、結合量が少なく、また、イミダゾールで溶出しても純度は50%程度であった。精製条件を再検討し、従来の可溶化レチナールタンパク精製法と比較する。
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